| 研究課題/領域番号 |
24791889
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
山岡 絵美(福田絵美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 研究員 (20403503)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 小児外科学 |
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| 研究概要 |
１）３遺伝子の神経芽腫細胞株への導入：３遺伝子導入実験を行い細胞の増殖、分化の検討を行った。予後不良例の初代培養細胞、および神経芽細胞腫細胞株の培養を行い、これらに予後良好腫瘍で高発現していた3遺伝子、NR0B1, DHRS3, CYP26A1遺伝子についてcDNAライブラリよりクローニングし取得した。それらをp3xFLAG CMV10にサブクローニングして発現ベクターを作成し、それらを神経芽細胞腫にトランスフェクションして一過性発現を検討、導入後G418薬剤選択により安定的遺伝子発現細胞株を樹立した。現在、遺伝子発現解析を行っている。
２）３遺伝子の神経芽腫細胞株へのＲＮＡ干渉：３遺伝子が高発現している神経芽腫細胞株で単独あるいは組み合わせてのsiRNAを一過性、または安定的に行い、経時的な細胞内分化関連シグナルの変化を遺伝子レベル、タンパク質レベルで解析した。３遺伝子のsiRNAを作成し一過性RNAiの効果を調べるべく神経芽細胞腫細胞株にトランスフェクションしたが、いずれもトランスフェクション効率が悪く、遺伝子発現解析、タンパク質発現解析において有意なノックダウンのデータが出なかった。このため、安定的な遺伝子ノックダウンを目指すべくBLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vevctor Kitsを用いて、３遺伝子のsiRNA発現ベクターを構築し、現在トランスフェクションを行い安定発現株を取得中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
神経芽細胞腫の細胞株におけるベクター、およびsiRNAのトランスフェクション効率が悪かったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
網羅的パスウェイ解析：ノックダウン実験、過剰発現実験で得た細胞の遺伝子発現プロファイルから、NR0B1, DHRS3, CYP26A1中心の分化関連パスウェイを検索し、実際に得た結果から作動あるいは欠損している伝達系を同定する。
３遺伝子のコンディショナルノックアウト動物の作製：３つの遺伝子のコンディショナルターゲティングベクターを構築し、ホモ改変マウス、致死的なものではヘテロやコンディショナルノックアウトマウスとして作製し病理組織学的に３つの遺伝子の機能解明を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
遺伝子発現解析の依頼測定、マウスの飼育費、コンディショナルノックアウト実験の費用として使用予定である。
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