2013 年度実施状況報告書

神経芽細胞腫予後良好３因子の分化機序の解明と治療法開発

研究課題

研究課題/領域番号	24791889
研究機関	広島大学
研究代表者	山岡絵美 (福田絵美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 研究員 (20403503)
キーワード	小児腫瘍学
研究概要	予後不良例の初代培養細胞、および神経芽細胞腫細胞株の培養を行い、これらに予後良好腫瘍で高発現していた3遺伝子、ヒトDHRS3, NR0B1, CYP26A1をサブクローニングし、3xFLAGタグを付加した発現ベクターにIntegrateしたものをLipofectamine LTXにて導入後、強制発現させ、一過性発現の発現レベルの変化を検討した。また、pIRES2　DsRed-Express2 vectorにて導入後G418薬剤選択により安定的遺伝子発現細胞株を樹立した。各種ベクターのみ導入したControlについても同様に検討した。次に、pcDNA6.2 GW/EmGFP-miR vectorを用いて、ヒトDHRS3, NR0B1, CYP26A1遺伝子を標的とした遺伝子発現阻害を行い、siRNA発現プラスミドベクターを導入し、ノックダウン効果の高い細胞をセルソーターにより選別し、３遺伝子の安定的RNAi株を樹立した。樹立された遺伝子発現細胞株をソフトアガーで培養し、導入前の細胞と比較して腫瘍形成能力、分化度に変化が生じたか検討し、細胞培養中に生じた幹細胞の豊富な分画、分化異常細胞からDNA・RNA、タンパク質を抽出し、Western blot、RT-PCR、FACS等で遺伝子発現を解析中である。既に解析済みの遺伝子発現、microRNA、メチル化解析のデータから、上記3遺伝子を中心としたシグナル伝達を遺伝子ネットワーク／パスウェイ解析システムにて解析を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 pcDNA6.2 GW/EmGFP-miR vectorを用いて各遺伝子を神経芽細胞腫の細胞に導入後、NH-12細胞株がシングルで接着せず、またセレクション中に脱落が多かったため実験を何度か繰り返しているうちに時間がかかってしまい、樹立が遅れている。
今後の研究の推進方策	３遺伝子のコンディショナルノックアウトターゲティングベクターの構築は、市販のマウスC57BL/6系統BACゲノムライブラリから目的遺伝子の遺伝子座近傍配列を入手し、組織特異的に欠損させるエキソン領域を挟むイントロンにloxP配列を挿入する。また、致死遺伝子としてHSV-TKを組み込む。ターゲティングベクターの構築はRed/ETを利用したシステムを用いて行う。３遺伝子のBACプラスミドベクターの導入された大腸菌に Red / ET 発現ベクターを形質転換し、Red/ETリコンビナーゼ発現誘導後、FRT カセットを導入する。カナマイシン耐性のある組換えE. coli を選別する。FLPe 発現プラスミドを形質転換してFLPe / FRT 組換えを行う。コンディショナルターゲティングベクターを其々作製する。マウスES細胞へのターゲティングベクターの導入と薬剤耐性選別については、構築したターゲティングベクターをC57BL/6系ES細胞株にエレクトロポレーション法によって導入後、G418による選択培養を行う。薬剤耐性のあるコロニーをピックアップし、サザンブロット、ハイブリダイゼーションで画像解析、PCR法によって相同遺伝子組換えされたクローンを選出する。キメラマウスの作成と生殖系列キメラの確認については、ノックアウトされた３遺伝子を有するマウスES細胞を培養し、胚盤胞期にできる腔にマイクロマニピュレーターを用いてマイクロインジェクション法でES細胞を注入、仮親の子宮へと移植し、キメラマウスを獲得する。キメラ率の高い産子のジャームライントランスミッションをサザンブロットで確認する。
次年度の研究費の使用計画	平成２５年１０月より平成２６年度９月まで産休、育児休業を取得したため次年度使用額が生じました。平成２６年度の予算とあわせ、遺伝子、タンパク質解析用試薬、細胞培養関連試薬、マウスＥＳ細胞へのターゲティング関連試薬、マウスの購入、飼育費などに使用する。