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本年度は暗期性の振動を示すBmal1遺伝子のプロモーター上に高い頻度でROREと新規配列が存在し、この新規転写因子とPeriodがBmal1遺伝子の転写を抑制することを見出した。そこで、この新規転写因子が時計遺伝子Periodタンパク質の挙動を制御している可能性について解析を行った。
まず、HEK293T細胞にFlag標識したPer2と新規転写因子を一過性に発現させ、免疫沈降法によりそれぞれのタンパク質の結合について解析を試みた結果、新規転写因子とPer2タンパク質が相互作用することが明らかとなった。次にこのタンパク質間相互作用がPer2の挙動に与える影響について、細胞免疫染色、Western blotting、Per2タンパク質の半減期を測定することで評価した。COS7細胞を用いて細胞免疫染色を行った結果、Per2を単独発現させると細胞質、核ともに細胞全体に発現が認められるが、新規転写因子を共発現させるとPer2は主に核に移行することが明らかとなった。さらに細胞回収時に核および細胞質を分画しWestern blottingを行った結果、新規転写因子を共発現させる事で核内Per2発現量は著明に上昇した。さらに、Casein Kinase I によるPer2タンパク質分解を半減期を測定し評価したところ、新規転写因子によってPer2タンパク質の分解は抑制されることが明らかとなった。
以上の結果から、新規転写因子はPer2タンパク質との相互作用を介してPer2の分解、核移行を制御する。本研究の遂行によって、新規転写因子とPeriodが時計遺伝子の転写制御に関する新たなフィードバック機構を形成する可能性があり、その機能制御を通じて概日リズム発振分子機構の確立に寄与できることが期待される。
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