研究課題
グルタミン酸発酵菌であるCorynebacterium glutamicumのグルタミン酸排出を担うとされるメカノセンシティブチャネルNCgl1221による、グルタミン酸排出機構を構造生物学的に明らかにすることを目的として、本年度も引き続きNCgl1221の結晶化を行った。前年度までに、NCgl1221の大腸菌での異種発現と精製法は確立しており、精製タンパク質を用いて結晶化スクリーニングを様々な界面活性剤を添加剤として用いて行った。微結晶が確認された条件について条件の最適化を一部行ったが、これまでに良質なX線回折データは得られていない。結晶化スクリーニングや結晶化条件の最適化には大量のタンパク質が必要となるため、ジャーファーメンターを利用した大量調製を目指した。発現株や培地などの条件を検討し、これまでよりも多くの組換タンパク質を安定に調整できる方法を確立しつつある。また、C. glutamicumにおける発現系も前年度までに構築を進めており、発現は確認できた。しかしながら、発現plasmidの保持が不安定であり、こちらの発現系を利用するには至っていない。これとは別に、グルタミン酸発酵時の代謝変化にアセチル化などの翻訳後修飾が関わっていることが示唆されていることから、排出を担うNCgl1221についても翻訳後修飾を受け、活性調節を受ける可能性を考えた。C. glutamicumから調製したNCgl1221を用いて、抗アセチルリジン・抗スクシニルリジン抗体を利用して、アシル化修飾を受けているかどうかを調べたが、NCgl1221はアシル化修飾を受けてはいなかった。NCgl1221は他のメカノセンシティブチャネルと異なりC末側に機能未知ドメインをもつため、アシル化修飾ではなく、このドメインが活性調節に関わる可能性を考え、トランケート体やC末ドメインのみの結晶化も進めている。
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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ACS SyntheticBiology
巻: 3 ページ: 21-29
10.1021/sb400059y
http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/biotec-res-ctr/MBT/
