| 研究概要 |
哺乳類における概日時計の中枢は視床下部視交叉上核に存在する。概日リズム発振メカニズムは現在までの所、時計遺伝子の転写・翻訳を介したネガティブフィードバックループ仮説が有力であり、時計遺伝子の一つであるCryptochrome (Cry)は概日リズムに必須な遺伝子であると考えられてきた。しかしながら申請者はCry1, Cry2ノックアウトマウスの視交叉上核の単一細胞には概日リズムが存在することを明らかにした。さらに生後間もない時期は視交叉上核の個々の細胞は同調したリズムを示すのに対し、成獣では脱同調することも見いだした。本年度はCry依存型、非依存型の視交叉上核における細胞間カップリングのメカニズムを明らかにするため実験を行った。
細胞内cAMPは細胞間カップリングに重要な役割を示すことが示唆されている。そこでアデニル酸シクラーゼ活性を阻害する薬剤をCry1,2 ダブルノックアウトマウスの幼若の培養視交叉上核に投与した。薬剤投与により個々の細胞がただちに脱同調し、個々の細胞のリズムは様々な周期を示した。この結果は、幼若期の細胞間カップリングにはcAMPが関与していることを示唆する。またCry1,2 ダブルノックアウトマウスの成獣の培養視交叉上核に異なる神経ペプチドを投与しPER2::LUCリズムの変化を検討した。今後はこれらペプチドと生後発達に伴う細胞間カップリングの変化との関係性に着目して実験を進めていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度は、昨年度行った各種阻害実験の結果に基づき、細胞内cAMPと新生児Cry1,2ダブルノックアウトマウス視交叉上核における細胞間カップリングとの関係性を明らかとする。視交叉上核に発現しているVIPはGタンパク質を介して細胞内cAMPを上昇させ、細胞間カップリングに重要であると考えられている。そこでCry1,2 KO,Vipr2KOのトリプルノックアウトマウスを作成し、細胞間カップリングのメカニズムに迫る。さらに成獣Cry1,2ダブルノックアウトマウス視交叉上核の脱同調とVIP, cAMPシグナル経路との関係性を明らかにする。また細胞内カルシウムと細胞間カップリングとの関係性を新生児Cry1,2ダブルノックアウトマウス視交叉上核を用い検討する。
CRY依存的細胞間カップリングと、傍分泌型細胞間カップリングとの関係を明らかとするために、VIP, AVP, GRPの遺伝子発現、及び細胞内のタンパク量が発達段階に伴いどのように変化しているかを確認する。新生児である生後７日目および成獣にあたる生後８週齢以上のマウスの視交叉上核の脳切片を作成し、発達に伴う遺伝子発現およびタンパク量の変化を検討するとともに、これらの概日リズムの変動パターンが新生児と成獣とで異なるかを検証する。
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