ネフロン前駆細胞自己複製法の開発

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24890171
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 神田 祥一郎 熊本大学, 学内共同利用施設等, 助教 (60632651)
• 研究期間 (年度): 2012-08-31 – 2014-03-31
• キーワード: ネフロン前駆細胞 / Sall1 / Six2

研究概要

A.　ネフロン前駆細胞自己複製法の開発：申請者はSix2(ネフロン前駆細胞に特異的に発現している転写因子)-GFPトランスジェニックマウスを用いGFPをマーカーとしたFACSソートによりネフロン前駆細胞の単離培養に成功していた。
1)　ネフロン前駆細胞培養条件の確立：既にLIFを添加することでほぼ100%のネフロン前駆細胞を未分化な状態で維持することを見出していたが、さらにCHIR(GSK阻害薬）を加えることでそれを未分化なまま増殖させられることを見出した。　2)　gp130ノックアウトマウスの解析：gp130はLIFの受容体であるがそのノックアウトマウス胎仔腎は低形成腎を呈していた。LIFが腎臓発生において重要な役割を果たしていることが分かった。
B.　ネフロン前駆細胞における未分化性維持機構の解明：ネフロン前駆細胞を特徴づける転写因子Six2とSall1の制御する遺伝子群を明らかにし、ネフロン前駆細胞における未分化維持機構を解明する。
1)　Six2、Sall1の転写複合体の形成：Sall1Flagノックインマウス胎仔腎を用いて、抗Flag抗体による免疫沈降を行い、両者が複合体を形成することが分かった。　　2)　Six2、Sall1の標的遺伝子同定：Six2、Sall1抗体によって、マウス胎仔腎を用いてChIP-seqを行った。これまでマウス胎仔腎を用いたChIP-seqの報告はほとんどなかったが、良好な結果を得ることができた。Six2とSall1が多くの腎臓発生に重要な遺伝子のプロモーター領域に結合していることやそれぞれの標的配列などが明らかとなった。
以上によりSall1はSix2と複合体を形成し、多くの腎臓発生に重要な遺伝子群の発現を制御することで、ネフロン前駆細胞を維持していることが分かった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

これまでマウス胎仔腎を用いたChIP-seqの報告はほとんどなかったので良好な結果を得ることができたことは、大変驚きであった。これにより研究は急速に進展し、1年間の交付期間内に論文投稿を行うことができた。
2012年秋に他の研究室から胎仔腎におけるChIP-seqの信頼できる報告(J.S.Park, Dev Cell, 2012)があり,著者に直接連絡を取り実験プロトコールを頂いたことが大きかったと考えている。

今後の研究の推進方策

(1)Sall1およびSix2の制御する遺伝子群がChIP-seqにより明らかとなったので、その情報をもとにネフロン前駆細胞自己複製法の改良につなげたい。
(2)申請者は2013年4月より東京女子医科大学腎臓小児科に勤務することになっている。患者様の多くは先天性腎尿路奇形のために腎不全となっている方々である。これまでマウスを用いて腎臓発生研究を行っていたが、これからはそれに加え、患者様の遺伝子診断、患者様検体を用いての新規原因遺伝子発見など、基礎と臨床とを結ぶ研究を行いたい。
(3)まずは論文投稿に対するrevise実験を行いたい。

研究成果

• [学会発表] Sall1 is essential for the maintenance of nephron progenitors. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shoichiro Kanda
  • 学会等名: Pediatric Academic Societies 2013
  • 発表場所: Washington Convention Center
  • 年月日: 20130504-20130507
• [学会発表] The role of Sall1 in the kidney development (2012)
  • 著者名/発表者名: 神田祥一郎
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: マリンメッセ福岡 3F サブアリーナ
  • 年月日: 20121211-20121214