シナプスにおける逆行性シグナルが生後発達期の機能的神経回路形成に果たす役割の解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25000015
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 狩野 方伸 東京大学, 医学系研究科, 教授 (40185963)
• 研究分担者: 崎村 建司 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40162325) ; 少作 隆子 金沢大学, 保健学系, 教授 (60179025) ; 橋本 浩一 広島大学, 医歯薬保健学研究科, 教授 (00303272)
• 研究期間 (年度): 2013 – 2017
• キーワード: シナプス / シナプス刈り込み / 生後発達 / 神経回路 / 逆行性シグナル / 小脳 / 登上線維 / マウス

研究実績の概要

◆平成26年度までに絞り込んだ10種類以上の候補遺伝子のうちで。平成27年度は、①膜貫通型セマフォリンの1サブタイプ、②細胞接着分子プロトカドヘリンの1サブタイプ、③増殖因子insulin-like growth factor 1 (IGF-1)で活性化されると考えられる膜蛋白分子、④代謝型グルタミン酸受容体と相互作用して逆行性シグナルを担うと考えられる膜蛋白分子、を集中的に解析した。上記①のノックダウン(KD)では、発達期にシナプス刈り込みが促進していたが、上記②、③、④のKDでは、いずれもシナプス刈り込みが障害されていた。上記②のKDでは生後12日で既に異常がみられ、シナプス刈り込みのearly phaseに異常があることが示唆された。◆脳由来神経栄養因子(BDNF)のプルキンエ細胞特異的ノックアウト(KO)マウスでは、生後2週目までは異常はなかったが、生後3週目にシナプス刈り込みが障害されていた。分泌性細胞認識分子granulinのプルキンエ細胞特異的KOマウスでは、生後2週目にシナプス刈り込みが促進していた。◆登上線維に発現するBDNFおよびgranulinの受容体の解析を継続し、BDNFは登上線維のTrkBに作用してシナプス除去を促進し、granulinは登上線維に発現する受容体に作用してシナプス除去に対抗することを解明した。◆幼若期からバーグマンググリア特異的にグルタミン酸トランスポーター(GLAST)をKDすると、GLAST KOマウスの表現型と同様の登上線維シナプス刈り込みの異常を認めた。◆登上線維を2種類のgenetically encoded Ca2+ indicatorで標識し、生後10～15日に登上線維の挙動をin vivoで観察するための条件検討を行った。◆プルキンエ細胞特異的P/Q型Ca2+チャネルKOマウスについて、生後第1週目と2週目のマウス小脳から多数のプルキンエ細胞の活動を、2光子顕微鏡によるin vivoの多細胞同時Ca2+ imagingにより計測し、登上線維応答の生後発達を調べた。◆細胞接着分子プロトカドヘリンの1サブタイプを大脳皮質でKDしたが、シナプス発達と機能に影響はなかった。◆大阪大学の木村らとの連携により、発達期の大脳体性感覚野の機能的神経回路発達に内因性カンナビノイドの2-アラキドノイルグリセロールによるシナプス可塑性が関与するという予備的結果を得た。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初平成27年度に計画した研究内容については順調に達成し、ほぼ満足できる結果を得られた。「1. プルキンエ細胞発現分子の網羅的スクリーニングと候補分子の絞り込み」及び「2. プルキンエ細胞に存在する候補分子のin vivo実験系による解析」では、平成26年度までに264個のスクリーニングを終了した。スクリーニングは、ほぼプルキンエ細胞に強い発現を示すものから順番に行っており、一般的に発現レベルの低いものはpositiveな結果が得られる見込みが低いので、これでスクリーニングを実質的に完了したと判断した。このうちから、10種類以上の遺伝子がシナプス刈り込みに関わる逆行性シグナルの候補として絞り込まれ、平成27年度から本格的にこれらの詳しい解析を進めている。「3. 登上線維に発現する分子の解析」においては、プルキンエ細胞側からのシグナルの受容体の候補を登上線維側でノックダウンし、機能的に同定することを継続している。成果発表に関しては、平成25年度以来、登上線維シナプス刈り込みに関して既に10報の原著論文を発表しており、現在、8編を投稿中または投稿準備中である。上記以外の研究項目については、これら以外の研究項目については、バーグマングリアに発現する候補遺伝子のスクリーニングとin vivoでの小脳プルキンエ細胞の集団活動計測は、技術的に困難な点があったが、ほぼ問題を克服して、概ね当初の予定どおりに進行している。以上から、全体としてみれば、当初の計画以上に進展していると考えることができる。

今後の研究の推進方策

平成25、26、27年度の進展を踏まえ、以下の方策のもとに研究を推進する。
1. 平成26年度までに絞り込まれた候補遺伝子について、引き続いて詳しい電気生理学的解析を行う。また、シナプス刈り込みに関与する分子に関して、in situ hybridizationや免疫染色による発現解析を行う。(狩野担当)。既存のKOマウスの解析を継続する(橋本担当)。これまでに崎村が新たに作製した候補遺伝子のKOマウスについて、シナプス刈り込みの異常の有無についての解析を行う(狩野、橋本担当)。新たに同定した逆行性シグナル関連分子のうち、既存のKOマウスが入手できないものや、部位特異的KOマウスの作製が必要なものを新たに作製し(崎村担当)、その解析を行う(狩野・橋本担当)。これらは平成29年度まで継続する。
2. 登上線維に存在する候補分子のシナプス刈り込みへの関与の解析 : プルキンエ細胞からの逆行性シグナル候補分子と相互作用することが予測される候補分子を中心に、下オリーブ核においてKDし、発達期の登上線維シナプスに与える影響を電気生理学的に解析する。(狩野担当)。既存のノックアウトマウスを解析するとともに(橋本担当)、必要に応じて、新たにKOマウスを作製し(崎村担当)、その解析を行う(狩野・橋本担当)。これらは平成29年度まで継続する。
3. バーグマングリアに発現する候補分子の登上線維シナプス刈り込みへの関与の解析 : 候補分子のmiRNAをバーグマングリアに発現させるレンチウイルスベクターを生後1日のマウス小脳に注入し、生後12-14日または生後19-30日にプルキンエ細胞の登上線維の支配様式を電気生理学的に解析する(狩野、橋本担当)。必要に応じて新たにKOマウスを作製し(崎村担当)、その解析を行う(狩野・橋本担当)。これらは平成29年度まで継続する。
4. 登上線維の挙動のリアルタイム解析 : 下オリーブ核にCa2+ indicatorのGCaMPを発現させ、2光子顕微鏡によりin vivoで登上線維の活動によるCa2+シグナルと登上線維の挙動をリアルタイム観察する(山梨大・喜多村と連携)。野生型マウスで条件検討を行って最適なプロトコールを確立し、適宜、代表的な逆行性シグナル分子のKDまたはKOマウスの解析を行う(狩野担当)。平成29年度まで継続する
5. 小脳神経回路の動作の解析 : 登上線維シナプス刈り込みに異常があるKDまたはKOマウスにおいて、in vivoでプルキンエ細胞集団のCa2+ imagingにより登上線維活動の時空間パターンを計測し、刈り込み異常がin vivoの神経回路機能に影響するかを調べる。(狩野担当)平成29年度まで継続する。
6. 大脳皮質の受容野マップ形成の解析 : シナプス刈り込みや機能発達に関わる可能性の高い分子のうち、代表的なものを大脳バレル皮質または前頭皮質においてKDし、シナプス機能と発達に果たす影響を調べる(狩野担当)。平成29年度まで継続する。
7. 内因性カンナビノイドによる逆行性シナプス伝達の機能的神経回路形成における役割 : DGLαとCB1のKOマウスを中心に、内因性カンナビノイド系がシナプス伝達と機能的神経回路発達に果たす役割を、海馬、大脳バレル皮質(大阪大・木村と連携)、大脳視覚野(鳥取大・畠と連携)を中心に解析する(狩野、少作担当)。平成29年度まで継続する。

研究成果

• [雑誌論文] Emerging Roles of ARHGAP33 in Intracellular Trafficking of TrkB and Pathophysiology of Neuropsychiatric Disorders. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa T, Hashimoto R, Sakoori K, Sugaya Y, Tanimura A, Hashimotodani Y, Ohi K, Yamamori H, Yasuda Y, Umeda-Yano S, Kiyama Y, Konno K, Inoue T, Yokoyama K, Inoue T, Numata S, Ohnuma T, Iwata N, Ozaki N, Hashimoto H, Watanabe W, Manabe T, Yamamoto T, Takeda M, Kano M
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 7 ページ: 10594
  • DOI: 10.1038/ncomms10594
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Contribution of postsynaptic T-type calcium channels to parallel fibre-Purkinje cell synaptic responses. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ly R, Bouvier G, Szapiro G, Prosser H, Randa11 AD, Kano M, Sakimura K, Isope P, Barbour BJ, Feltz A
  • 雑誌名: J Physiol (Lond) 巻: 594 ページ: 915-936
  • DOI: 10.1113/JP271623
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Territories of heterologous inputs onto Purkinje cell dendrites are segregated by mGluR1-dependent parallel fiber synapse elimination. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa R, Hashimoto K, Miyazaki T, Uchigashima M, Yamasaki M, Aiba A, Kano M, Watanabe M
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 巻: 113 ページ: 2282-2287
  • DOI: 10.1073/pnas.1511513113
  • 査読あり
• [雑誌論文] Astroglial glutamate transporter deficiency increases synaptic excitability and leads to pathological repetitive behaviors in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Aida T, Yoshida J. Nomura M, Tanimura A, Iino Y, Soma M, Bai N, Ito Y, Cui W, Aizawa H, Yanagisawa M, Nagai T, Takata N, Tanaka K, Takayanagi R, Kano M, Götz M, Hirase H, Tanaka K
  • 雑誌名: Neuropsychopharmacology 巻: 40 ページ: 1569-1579
  • DOI: 10.1038/npp.2015.26
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Task-specific enhancement of hippocampus-dependent learning in mice deficient in monoacylglycerol lipase, the major hydrolyzing enzyme of the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto Y, Cagniard B, Yamazaki M, Nakayama J, Sakimura K, Kirino Y, Kano M
  • 雑誌名: Front Behav Neurosci 巻: 9 ページ: Article 134
  • DOI: 10.3389/fnbeh.2015.00134
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Implicit memory in monkeys : Development of a delay eyeblink conditioning system with parallel electromyographic and high-speed video measurements. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto Y, Yamamoto S, Suzuki K, Toyoda H, Kano M, Tsukada H, Kirino Y
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 ページ: e0129828
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0129828
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Fever is Mediated by Conversion of Endocannabinoid 2-Arachidonoylglycerol to Prostaglandin E2. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kita Y, Yoshida K, Tokuoka SM, Hamano F, Yamazaki M, Sakimura K, Kano M, Shimizu T
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 ページ: e0133663
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0133663
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Weeding out bad waves : Towards selective cannabinoid circuit control in epilepsy. (2015)
  • 著者名/発表者名: Soltesz I, Alger BE, Kano M, Lee S-H, Lovinger DM, Ohno-Shosaku T, Watanabe M
  • 雑誌名: Nat Rev Neurosci 巻: 16 ページ: 264-277
  • DOI: 10.1038/nrn3937
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Consensus Paper : Cerebellar Development. (2015)
  • 著者名/発表者名: Leto K, Arancillo M, Becker EB, Buffo A, Chiang C, Ding B, Dobyns WB, Dusart I, Haldipur P, Hatten ME, Hoshino M, Joyner AL, Kano M, Kilpatrick DL, Koibuchi N, Marino S, Martinez S, Millen KJ, Millner TO, Miyata T, Parmigiani E, Schilling K, Sekerkova G, Sillitoe RV, Sotelo C, Uesaka N, Wefers A, Wingate RJ, Hawkes R
  • 雑誌名: Cerebellum ページ: Epub ahead of print
  • DOI: 10.1007/s12311-015-0724-2
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 発達期におけるシナプス刈り込みと逆行性シグナル (2015)
  • 著者名/発表者名: 上阪直史、狩野方伸
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 33 ページ: 1386-1370
• [学会発表] 小脳皮質縞状構造への運動・認知行動に関連した登上線維入力の学習による分化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 堤新一郎、日高直樹、磯村宜和、松崎政紀、崎村建司、狩野方伸、喜多村和郎
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-24
• [学会発表] 内因性カンナビノイド2-AGは自閉症様行動に関与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 佐郡和人、山崎真弥、崎村健司、狩野方伸
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-24
• [学会発表] 苔状線維が放出するClqタンパク質による苔状線維-CA3シナプス機能の制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松田恵子、Timotheus Budisantosol、狩野方伸、渡辺雅彦、﨑村健司、A. Radu Aricescu、柚﨑通介
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-23
• [学会発表] 1型代謝型グルタミン酸受容体による網膜-外側膝状体シナプスの成熟型結合パタンの維持 (2016)
  • 著者名/発表者名: 鳴島円、内ヶ島基政、矢ヶ崎有希、原田武志、南雲康之、上阪直史、渡邉 貴樹、橋本浩一、饗場篤、渡辺雅彦、宮田麻理子、狩野方伸
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-22
• [学会発表] 前頭側頭型認知症関連遺伝子granulinが発達期小脳のシナプス再編成を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 上阪直史、狩野方伸
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-22
• [学会発表] 大脳-小脳ループの光マッピングによる解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋明貞、平理一郎、松崎政紀、狩野方伸、喜多村和郎
  • 学会等名: 第93日本生理学会大会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-03-22
• [学会発表] Neuroligin-2 regulates postnatal development of climbing fiber-Purkinje cell synapses in the cerebellum (2015)
  • 著者名/発表者名: Lai E, Uesaka N, Kano M
  • 学会等名: Neuroscience 2015
  • 発表場所: Washington DC (USA)
  • 年月日: 2015-10-21
  • 国際学会
• [学会発表] Rational design of ultrafast, high-affinity red calcium indicator for monitoring neuronal activity (2015)
  • 著者名/発表者名: Inoue M, Takeuchi A, Horigane S-I, Fujii H, Kamijo S, Takemoto-Kimura S, Ohkura M, Ggengyo-Ando K, Kano M, Nakai J, Kitamura K, Bito H
  • 学会等名: Neuroscience 2015
  • 発表場所: Washington DC (USA)
  • 年月日: 2015-10-18
  • 国際学会
• [学会発表] Rational design of a novel high-affinity, ultrafast, red calcium indicator R-CaMP2 (2015)
  • 著者名/発表者名: Inoue M, Takeuchi A, Horigane S, Ohkura M, Gengyo-Ando K, Fujii H, Kamijo S, Takemoto-Kimura S, Kano M, Nakai J, Kitamura K, Bito H
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-30
• [学会発表] Retrograde signaling involved in climbing fiber synapse elimination in the developing cerebellum (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano M, Uesaka N
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-29
• [学会発表] The endocannabinoid 2-arachidonoyl glycerol suppresses excitatory synaptic inputs around the inner and middle molecular layers of the dentate gyrus during seizures (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugaya Y, Yamazaki M, Sakimura K, Kano M
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-29
• [学会発表] Cortical excitatory/inhibitory imbalance in a mouse model for human 15q11-13 duplication (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakai N, Watanabe Y, Kawamura Y, Miyazaki T, Watanabe M, Okabe S, Kano M, Hashimoto K, Takumi T
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-29
• [学会発表] Knockdown of CNTNAP2 in neurons of the prefrontal cortex impairs synaptic function and causes impaired social behavior (2015)
  • 著者名/発表者名: Sacai H, Sakoori K, Uesaka N, Kano M
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-28
• [学会発表] Identification of complex spikes in two-photon recording of Purkinje cell calcium responses by machine learning and ROC analysis of the performance (2015)
  • 著者名/発表者名: Hoang H T, Tsutsumi S, Hashizume M, Yamashita O, Tokuda I, Sato MA, Kawato M, Kano M, Kitamura K, Toyama K
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-28
• [学会発表] Progranulin regulates climbing fiber synapse elimination during postnatal cerebellar development (2015)
  • 著者名/発表者名: Uesaka N, Abe M, Yamazaki M, Konnno K, Mikuni T, Watanabe M, Sakimura K, Kano M
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-28
• [学会発表] Roles of neuroligin-2 in inhibitory synaptic transmission and climbing fiber synapse elimination in Purkinje cells during postnatal cerebellar development (2015)
  • 著者名/発表者名: Lai S K, Uesaka N, Kano M
  • 学会等名: 第38回日本神経科学大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-07-28
• [学会発表] Multiple roles for neural activity in climbing fiber synapse elimination during postnatal cerebellar development (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano M
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Asia (CSHA) Conference on International Brain Projects
  • 発表場所: Suzhou(China)
  • 年月日: 2015-06-21
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Retrograde semaphorin signaling regulates synapse elimination in the developing mouse brain (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano M
  • 学会等名: Invited Lecture at Zhejiang University, College of Pharmaceutical Sciences
  • 発表場所: Zhejiang(China)
  • 年月日: 2015-06-17
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Crucial Roles of 2-Arachidonoylglycerol Signaling in the Suppression of Epileptic Seizures (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano M
  • 学会等名: Gordon Research Conferences Cannabinoid Function in the CNS
  • 発表場所: Tuscany (Italy)
  • 年月日: 2015-05-26
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Neuronal activity and retrograde signaling that regulate synapse elimination in the developing cerebellum (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano M
  • 学会等名: Invited Lecture at Institute of Neuroscience, Technische Universität München
  • 発表場所: München(Germany)
  • 年月日: 2015-05-22
  • 国際学会 / 招待講演