| 研究課題/領域番号 |
25220102
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| 研究機関 | 公益財団法人放射線影響研究所 |
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研究代表者 |
野田 朝男 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 副部長 (40294227)
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| 研究分担者 |
立花 章 茨城大学, 理学部, 教授 (20188262)
三谷 啓志 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (70181922)
濱崎 幹也 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 研究員 (80443597)
藤堂 剛 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90163948)
山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)
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| 研究期間 (年度) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| キーワード | 突然変異 / GFP / in vivo / 組織幹細胞 / 放射線 / リスク評価 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、放射線や環境変異原による体細胞や生殖幹細胞の突然変異リスクを、組織細胞の「場」、つまり組織の構築を壊すことなく生きたままの状態で測定するマウスおよびメダカシステムを作製することを第一の目標としている。具体的には、（１）突然変異が生じると細胞が生きたまま光る（GFP陽性となる）システムを個体レベルで達成する。（２）これを用いて、既存の系とは全く異なり、より直接的に体細胞突然変異リスクを評価することが可能な実験システムを確立する。最終的には、組織の再構築の場である組織幹細胞と、それから派生する分化して機能する細胞に対する環境・放射線リスク評価を個体を構成する全ての細胞についてin vivo、in situで可能とし、内在する分子メカニズムや遺伝的背景の影響研究へと踏み込む。（３）世界共通のin vivoリスク評価系としてのモデル動物を確立し、実用化レベルまで検査法を整えた後、広く配布する。本年度はモデルマウスシステムの完成と評価結果について論文を発表した。また、モデルメダカシステムの実行性も検証した。同時に、モデル動物の遺伝的背景を改変する目的でのTALEN-CRISPR システムの導入もマウス、メダカで行い、いくつかの修復遺伝子変異系統を作製した。生体組織内で生じる突然変異細胞の全ゲノム解析のシステムをメダカで準備した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
体内で生じる突然変異を生きたまま、ライブでとらえる（突然変異細胞が光る）事が可能なマウス系統（HPRTdupGFPマウス）の作製に成功した。このマウスでは少なくとも、肝臓、膵臓、小腸、肺、脾臓リンパ球、甲状腺上皮、精原細胞などで生じた突然変異細胞が蛍光顕微鏡下と凍結組織切片で観察できることが確認された。また、フローサイトメーター解析では、組織由来の変異細胞を生きたまま検出、分離が可能であった。マウス系統の確立を報告する論文をPlosOne 誌にて発表した。マウスの商業的用途としては、日本国内特許を取得した。研究用途としては広く配布する事を目的として公共の変異マウス資源バンク（例えば国立医薬基盤研究所バンク、理化学研究所生物資源バンク、アメリカジャクソン研究所マウス資源バンク）に寄託する計画を立てた。第二世代ノックインマウスとして、がん抑制遺伝子p53に変異が生じると細胞が光るマウス作製もほぼ最終段階であり、有効性を検証するところまで到達した。メダカでは、p53のLOH発生に依存した癌の発生をモニターするシステム（Mit-xmrk/p53(+/-)）が実用段階に入った。体の中で生じる突然変異細胞の全ゲノム解析のシステム構築も引き続き行った。分化した体細胞と、未分化組織幹細胞の突然変異成立過程の相違について、in vitro, in vivoでの実験システムを構築しつつある。突然変異細胞のみならず、被ばく細胞集団の同定を目的としたバイオマーカー探索作業も引き続き行い、候補遺伝子（蛋白質）の絞り込みを行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスシステム
HPRTdupGFPマウス （１）今後の作業：p53、ATMノックアウトマウスアリルの導入（すでに進行中）。28年度は53BP1ノックアウトアリルを導入する。53BP1KOマウスはジャクソン研究所から分譲予定。精原細胞変異の測定：精原細胞の同定と分離により変異頻度の測定を行う。これまでCD9/CD326EpCAM抗体で精原細胞をFACS解析していたが、不完全であるとの指摘を受け、E-cadherin抗体を追加する。（２）バックグラウンド問題点の解決策：あらかじめ存在するGFP陽性細胞を消去する２つの方法（Nature Str Mol Biol 19:117, 2012; Cell 154:928, 2013）の導入を検討する。p53-GFPマウス （１）In vivo発がんのモデル実験を行う。
メダカシステム
HPRTdupGFPメダカ （１）今後の作業：28年度にトランスジェニックメダカを作製する。体細胞変異頻度の測定。p53、ATM、 BRCA1、Rev1アリルを欠損したメダカと交配することにより変異細胞の検出感度上の有無を検証する。生殖細胞変異測定。精原細胞と減数分裂後の精原細胞の変異頻度の比較を行う。（２）問題点の解決策：マウス同様に、バックグラウンドによる個体差を抑える操作が必要になった場合は、6TG投与を試みる。Mit-xmrk/p53(+/-)メダカ （１）今後の作業：近交系Mit-xmrkとp53(+/-)を交配して目的メダカを作製する。発生メラノーマと放射線によるp53アリルのLOHについて解析する。
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