| 研究課題/領域番号 |
25220204
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
前田 瑞夫 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 主任研究員 (10165657)
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| 研究分担者 |
宝田 徹 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 専任研究員 (30336010)
藤田 雅弘 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 専任研究員 (50342845)
金山 直樹 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 研究員 (80377811)
秋山 好嗣 東京理科大学, 基礎工学部, 講師 (40640842)
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| 研究期間 (年度) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| キーワード | 核酸 / 細胞・組織 / 生体材料 / ゲル / ソフト界面 |
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| 研究実績の概要 |
１．DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御： ローリングサークル増幅法の反応条件を改善して、長鎖の鋳型DNAを効率的に合成した。従来よりも大きい金ナノ粒子（粒径15 nm）を鋳型上に配置して糸ビーズ状集合体を作製し、透過型電子顕微鏡で観察した。予想通り、粒子表面のDNAが完全相補の場合のみ円盤状に収縮したが、従来の粒径5 nmのものに比べて円形度が著しく低くなるという興味深い結果が得られた。
２．刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発： ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAAm）とDNAの共重合体の自己集積化によるナノ粒子形成のメカニズムを解明した。粒子形成の塩濃度依存性とDNA鎖構造依存性を調べた結果、DNA鎖間の相互作用を起点とするのではなく、PNIPAAm鎖同士の集積をきっかけにして粒子が形成されることを確認した。二重鎖DNAを有する共重合体の濁度変化は、あくまで自己集積後の粒子同士の凝集によることを実証した。
３．DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発： DNA界面間に働く表面力に着目し、コロイドプローブAFM法による水中フォースカーブ測定を行った。その結果、相補的な表層のDNA界面間では溶液のNaCl濃度の上昇に伴って表面力が斥力から引力へ徐々に変化するのに対し、表層がミスマッチ配列のDNA界面間では溶液のNaCl濃度に関係なく斥力が観測されるという興味深い結果が得られた。
４．DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発： ヒト由来のシトクロムP450 2C19遺伝子を用いたSNP診断を実施した。3名の被験者の毛根細胞からゲノムを抽出し、標的遺伝子をPCR増幅した。これを鋳型として一塩基伸長反応を行い、高イオン強度下で非架橋凝集を誘起させた。鮮やかな色調変化が数分以内に生じ、SNPを迅速に目視判別することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
１．DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御： DNA担持金ナノ粒子の糸ビーズ状集合体の作製と構造変換については、計画通りに進んでいる。それ以外の成果として、DNA担持金ナノロッドについても非架橋凝集に基づくSNP診断が可能なことを実証した。さらに、水銀イオンが介在する非天然型塩基対合を活用して、DNA担持金ナノロッドの横並び集合体と縦並び集合体を相互変換することに世界で初めて成功した。
２．刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発： 温度応答性高分子のPNIPAAmをベースとした刺激応答性DNA担持ハイドロゲルの創製とともに、その前駆体となるナノ粒子の形成メカニズムを明らかにすることを目的とした。DNA構造に明敏に応答する粒子の分散安定性の変化は、粒子あるいは分子集合体ミセル特有の現象であり、分子鎖単体では生じないことが明らかになった。すなわち、DNA鎖同士の物理的な引力相互作用によってもたらされるものではないことが実証された。
３．DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発： 本年度実施したコロイドプローブAFMによる水中フォースカーブ測定により、DNA界面間では表層塩基対合に依存した表面力が働くことを実験的に確認できた。このことは、DNA界面の特性が表層塩基対合に依存して変化することを意味する。今後、タンパク質などの異種生体材料の吸着特性に反映されることが期待できる。
４．DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発： モデル遺伝子（化学合成品）で示した精密な目視SNP診断法が、ヒト由来の遺伝子産物にも適用可能であることを実証した。被験者（3名）の毛根細胞から抽出したゲノムDNAのシトクロムP450遺伝子を鋳型としてジデオキシ鎖終結法を行ない、得られたサンプルを用いて比色分析を実施した。その結果、ヒト由来の遺伝子を用いても正確に目視SNP診断をすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御： 完全相補の二重鎖DNAを担持した金ナノ粒子と末端ミスマッチ二重鎖を担持した粒径の異なる金ナノ粒子を同一の鋳型DNAの上に順序を制御して配列させ、コロイド安定性に著しい差がある異種粒子が線状に並んだ糸ビーズ状集合体を作製する。さらに、集合体内あるいは集合体間で非架橋凝集を誘起したときに生じる構造変化を顕微観察と光散乱法で調べる。
２．刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発： 架橋型ハイドロゲルに関しては、構造の温度応答性についての詳細が明らかになり、物質包接能を有していることが明らかになっている。第三成分として導入する反応性モノマーの導入比率や架橋剤の長さを変えることで、架橋点間距離が精密に制御されたナノゲルの作製を試みるとともに、包接・徐放特性との相関を構造解析ならびに分光学的な点から明らかにする。
３．DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発： DNA界面とタンパク質間に働く相互作用を、水晶子マイクロバランス法により評価し、DNA界面の表層塩基対合がタンパク吸着挙動に及ぼす影響を評価する。
４．DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発：東京理科大学（長万部キャンパス）の学生ボランティア（20名以上）を被験者とした目視SNP診断を実施する。複数の標的遺伝子（シトクロムP450遺伝子と内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子を予定）を診断対象として、本分析法の汎用性を証明する。
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