| 研究課題/領域番号 |
25220204
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
前田 瑞夫 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 主任研究員 (10165657)
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| 研究分担者 |
宝田 徹 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 専任研究員 (30336010)
秋山 好嗣 東京理科大学, 基礎工学部教養(長万部), 講師 (40640842)
藤田 雅弘 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 専任研究員 (50342845)
金山 直樹 信州大学, 総合工学系研究科(長野), 准教授(特定雇用) (80377811)
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| 研究期間 (年度) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| キーワード | 核酸 / 細胞・組織 / 生体材料 / ゲル / ソフト界面 |
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| 研究実績の概要 |
１．DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御： DNA担持金ナノ粒子の糸ビーズ状集合体に非架橋凝集を誘起すると、基板表面上で円盤状に自己組織化して、金ナノ粒子の２次元アレイが自発的に生成することを明らかにしてきた。今年度は、集合体内部の粒子間距離や、粒子表面DNAの鎖長、金ナノ粒子の粒径などを変化させると、さまざまな形状の２次元アレイができることを見出した。
２．刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発： 反応性側鎖を有するモノマーを第二成分としたポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）共重合体の片末端に、オリゴDNAをカップリングさせた三成分共重合体を合成した。ミセル形成中に架橋剤を添加して、分散安定性の高いナノゲルを簡便に作成することに成功した。このナノゲルは、温度変化で膨張と収縮が起きるため、内包した疎水性化合物を温度に応答して除放できることが明らかになった。
３．DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発： 昨年度より引き続き、DNA界面間で発生する表面力における表層塩基対合依存性に関して、コロイドプローブAFM測定によるフォースカーブの解析を行った。その結果、高濃度下ではDNA界面表層の塩基対合の有無に連動して、表層核酸塩基近傍の局所的な水和状態が異なり、これが表面力の差に反映されていることが強く示唆された。
４．DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発：ヒト毛根細胞から抽出したシトクロムP450 2C19遺伝子を用いた目視SNP診断法の結果が、DNAシーケンサーで解読した配列と完全に一致することを確認し、その正確性を実証した。また、DNA担持ナノ粒子の非架橋凝集を利用して、さまざまな薬剤候補物質についてDNAトポイソメラーゼ（TOPO）の阻害効果を簡便に目視判定する方法を考案し、その概念実証実験に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
１．DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御： DNA担持金ナノ粒子の糸ビーズ状集合体の構造変換については、ほぼ計画通りに進んでいる。これ以外に、当初の計画にはなかったDNA担持金ナノプレート集合体の配向制御にも取り組み、水平方向にタイル状に並んだ集合体と、垂直方向に積み上がった集合体を選択的に作成することに世界で初めて成功した。
２．刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発： 架橋型ハイドロゲル（ナノゲル）に関し、ゲル構造の温度応答性や架橋点間距離との相関を小角X線構造解析により明らかにした。さらに、薬剤モデル化合物として疎水性蛍光物質を内包させることにより、ゲル構造の温度応答性と、内包物の包接・除放特性との相関を、蛍光寿命測定などの分光学的手法によって明らかにすることができた。
３．DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発： コロイドプローブAFMによるフォースカーブ測定により、DNA界面間では表層塩基対合に依存した表面力が発生することを実験的に確認できた。さらに、DNA界面表層の核酸塩基部位の水和状態が、塩基対合の有無に連動して局所的かつ明瞭に異なっていることが示唆された。
４．DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発： これまでに開発した目視SNP診断法がヒト由来の実サンプルに適用できることを、DNAシーケンサーによる解析結果との照合によって証明した。さらに今年度は、当初の計画にはなかったトポイソメラーゼ（TOPO）阻害剤の目視スクリーニング法の構築にも着手した。モデル実験として、既知の抗がん剤（カンプトテシン）と断片DNA（市販品）をDNA担持金ナノ粒子と混ぜると、高イオン強度下において、非架橋的な凝集が誘起されて、鮮やかな色調変化をもたらした。本技術は、目視による簡便な薬物スクリーニング法への展開が期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
１. DNA担持ナノ粒子の糸ビーズ状集合体について、短鎖（3量体）と長鎖（300量体以上）のものを作製し、非架橋凝集現象で誘起される構造変化を明らかにしてきた。最終年度は、分散安定性の異なるナノ粒子を同じ鋳型DNAに規則的に配置した長鎖の糸ビーズ状集合体を作製し、非架橋凝集を誘起した際の構造変化を透過型電子顕微鏡で観察する。さらに、構造変換のトリガーとして酵素による脱リン酸化を使うことを検討し、クロマチンをモデルとした形状可変型ナノ材料を開発する。
２. 最終年度は、温度応答性高分子がもたらす構造変化によって、金属ナノ材料が有する特異な光学特性をチューニング可能な新しい機能性ハイドロゲルの作製と特性評価を推進する。本プロジェクトで蓄積された高分子合成技術を駆使し、さまざまな分子骨格を有するDNA-温度応答性高分子共重合体を創製し、DNA部位を鋳型として金属ナノ材料と複合化する。その光学特性の温度応答性と構造変化との相関を明らかにする。
３. 二重鎖DNAがブラシ状に集積したDNA界面は、自由末端近傍の塩基対構造に依存して特性が変化し、DNA界面間相互作用に反映されることを明らかにしてきた。最終年度は、自由末端側の塩基対構造の異なる様々なDNA界面への細胞培養の培地成分の相互作用、さらには培養細胞の接着挙動を評価する。得られた成果から、DNA界面の自由末端構造依存的な界面特性と異種生体材料との相互作用を総括する。
４. DNA担持金ナノ粒子の非架橋凝集を用いた、シトクロムP450遺伝子の一塩基多型（SNP）目視識別法を開発する。被験者24名の毛根細胞から抽出した標的遺伝子について、マイクロプレートによるSNP目視識別を実施することで、本分析手法の有効性を実証する。さらに、本法とマルチプレックスPCR法を組み合わせることにより、複数遺伝子のSNPを同時に目視識別することを目指す。
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