哺乳類概日振動体の構成的な理解

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25221004
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 上田 泰己 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20373277)
• 研究分担者: 田井中 一貴 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80506113) ; 大出 晃士 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40612122) ; 洲崎 悦生 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10444803)
• 研究期間 (年度): 2013-05-31 – 2018-03-31
• キーワード: 概日振動 / リン酸化 / 温度補償性 / 自律発振機構 / 変異マウス作成

研究概要

本研究課題では、未だに解明されていない哺乳類概日時計の持つ温度補償性の分子機構の理解を目標に掲げている。具体的には、試験管内で再現されたCKIε/δによるPER2ペプチドのリン酸化過程の温度補償性を解析し、温度補償性を生み出す基質と酵素を設計可能な程まで理解すること、また、温度補償性を制御する化合物を設計し、概日周期の温度補償性の制御を可能とすることを課題の一つとして設定している。
CKIε/δによるPER2ペプチドのリン酸化過程は温度補償性が保たれているものの、複雑な多段階反応が生じるため、PER2ペプチドそのものを用いて温度補償性の分子機構を解明するのは困難である。当該年度において我々は、リン酸化ペプチドの量比を経時的かつハイスループットに解析可能なモビリティーシフトアッセイを用いて、温度補償性が担保されている、より単純なペプチドモデル系の探索を行った。その結果、興味深いことにリン酸化部位をわずか１箇所しか含まないにも関わらず温度に依存しないリン酸化反応を示すペプチドモチーフを見出した。
また、概日周期の頑強な温度補償性がCKIδのリン酸化過程に由来すると仮定すると、CKIδに温度補償性を生み出す機能が内在的に備わっているはずである。そこで、一連のCKIδの変異体を網羅的に作製し、試験管内においてリン酸化活性を評価したところ、変異導入によりCKIδのリン酸化活性の温度依存性が著明に変化するアミノ酸部位を同定した。
更に、ハイスループットなモビリティーシフトアッセイを用いてLOPACのケミカルライブラリからリン酸化活性に対する薬剤のケミカルスクリーニングを行った結果、CKIδのリン酸化反応の逆反応を効率的に阻害するリード化合物を発見した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究課題において、生化学反応のリン酸化反応に温度補償性があることは、１）温度上昇に伴う酵素と基質の親和性の低下、もしくは逆反応速度の亢進による補償機構、２）共有結合の切断を伴わない酵素・基質の結合解離などの温度に依存しにくい過程が律速である温度非依存機構、のいずれかを示唆していることを提案している。これらの仮説を検証するためには、多段階に及ぶリン酸化過程を単純化し、酵素と基質の間の親和性や結合・解離速度、逆反応の有無、及び正反応・逆反応の温度依存性等を緻密に定量可能な評価系を構築しなければならない。
当該年度において、我々はリン酸化部位をわずか１箇所しか含まないにも関わらず温度に依存しないリン酸化反応を示す、極めて単純なペプチドモチーフを見出すことに成功した。このことから、当初の計画通り、NMRによる酵素・基質の複合体構造解析や、等温滴定型熱量計、表面プラズモン共鳴センサー、1分子蛍光分析システムによる分子間相互作用解析を通じて、温度補償性の分子機構を精密に評価する基盤が整った。また、CKIδ変異体のリン酸化活性評価から、温度補償性に寄与する一連のアミノ酸残基の同定に成功した。従って、次年度以降の研究目標として定めていた『温度補償性を有する基質・酵素が設計可能な程まで設計原理を理解する』ために必要な基礎的知見は既に得られた。
更に、ハイスループットなモビリティーシフトアッセイによるケミカルスクリーニングを通じて、CKIδのリン酸化反応の逆反応を効率的に阻害するリード化合物を発見した。従って、次年度以降の研究目標として定めていた『振動周期を加速する』候補分子の探索に成功しており、『概日振動の制御』のために必要な基盤が整いつつある。

今後の研究の推進方策

単純化したリン酸化モデルペプチドの発見、及びCKIδにおいて温度補償性に寄与する一連のアミノ酸残基の同定に成功したことから、温度補償性の分子機構を解析する基盤が整っている。次年度は、これらの知見を元に１）温度上昇に伴う酵素と基質の親和性の低下、もしくは逆反応速度の亢進による補償機構、２）共有結合の切断を伴わない酵素・基質の結合解離などの温度に依存しにくい過程が律速である温度非依存機構、の二つの仮説を検証し、リン酸化反応において温度補償性を生み出す分子機構の解明に取り組む。具体的には、NMRによるCKIδと基質ペプチドの複合体の構造解析、及び、等温滴定型熱量計（ITC）、表面プラズモン共鳴センサー（Biacoreシステム）、1分子蛍光分析システム（MF-20）を用いた定量的かつ動力学的な分子間相互作用解析を行うことで、酵素と基質の間の親和性や結合・解離速度、逆反応の有無、及び正反応・逆反応の温度依存性を定量する。
また、試験管内で再構成された温度非依存的なリン酸化反応が、細胞レベルで概日時計の温度補償性に寄与していることを検証するために、CKIδを細胞内で過剰発現させ、Periodタンパク質の安定性に対する温度依存性を評価する。更に、CKIε/δもしくはPer1/2ダブルノックアウト細胞にCKIε/δやPer1/2発現プラスミドを一過的に導入し概日周期を再現するノックアウト細胞レスキュー系の構築に取り組み、試験管内で予想される表現型が得られるかを評価する。
更に、上記で見出された動作原理の生物学的・医学的意義を検証するために、ノックアウトマウスレスキュー系を用いた個体レベルでの仮説検証に向けた準備を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis (2014)
  • 著者名/発表者名: Etsuo A. Susaki, Kazuki Tainaka, Dimitri Perrin, Fumiaki Kishino, Takehiro Tawara, Tomonobu Watanabe, Chihiro Yokoyama, Hirotaka Onoe, Megumi Eguchi, Shun Yamaguchi, Takaya Abe, Hiroshi Kiyonari, Yoshihiro Shimizu, Atsushi Miyawaki, Takeshi Imai, Hideo Yokota and Hiroki R. Ueda.
  • 雑誌名: Cell 巻: 157 ページ: 726;739
  • DOI: 10.1016/j.cell.2014.03.042
  • 査読あり
• [雑誌論文] Non-enzymatic DNA cleavage reaction induced by 5-ethynyluracil in methylamine aqueous solution and application to DNA concatenation (2014)
  • 著者名/発表者名: Shuji Ikeda, Kazuki Tainaka, Katsuhiko Matsumoto, Yuta Shinohara, Koji L. Ode, Etsuo A. Susaki and Hiroki R. Ueda
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 9 ページ: e92369
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0092369
  • 査読あり
• [学会発表] Systems and Synthetic Biology of Biological Timings (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第78回日本循環器学会学術集会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム（東京）
  • 年月日: 20140321-20140321
  • 招待講演
• [学会発表] Spaciotemporal gene expression profiling with efficient brain clearing cocktails and computation、Gordon Research Conference: Sleep Regulation & Function The Science of Sleep: Emerging Themes and Paradigm Shift (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: Gordon Research Conferences
  • 発表場所: Hotel Galvez(アメリカ合衆国)
  • 年月日: 20140317-20140318
• [学会発表] Overview of “systems biology approach and circadian rhythm” and implication to radiobiology (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: Tentative program of the 6th International Systems Radiobiology worｋshop
  • 発表場所: NIRS Lecture Hall（千葉）
  • 年月日: 20140306-20140306
  • 招待講演
• [学会発表] QBiCにおける合成生物学研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: QBiCスプリングコース2014
  • 発表場所: 大阪大学（大阪）
  • 年月日: 20140303-20140303
  • 招待講演
• [学会発表] 個体レベルのシステム生物学の実現に向けて—体内の「時間」を理解する— (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 慶應義塾大学医学部眼科学教室カンファレンス
  • 発表場所: 慶應義塾大学（東京）
  • 年月日: 20140213-20140213
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞比率ネットワークと細胞ヘブ学習則の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: セルイノベ公開シンポジウム
  • 発表場所: コクヨホール（東京）
  • 年月日: 20140128-20140128
  • 招待講演
• [学会発表] 個体レベルのシステム生物学の実現に向けて (2014)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 自然科学研究機構新分野創成センターシンポジウム 大規模脳神経回路機能マップのその先
  • 発表場所: 星陵会館（東京）
  • 年月日: 20140112-20140112
  • 招待講演
• [学会発表] 個体システムの「時間」の理解に向けて (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 朝日医学・医療セミナー
  • 発表場所: 中央労働センター（兵庫）
  • 年月日: 20131207-20131207
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝子発現のゆらぎ・学習の動作原理を測る・導く (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会（ワークショップ）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫）
  • 年月日: 20131203-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] 個体レベルのシステム生物学に向けたイメージングの役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会（ランチョンセミナー）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫）
  • 年月日: 20131203-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] 個体レベルのシステム生物学の実現に向けて―体内の「時間」を理解する― (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第３回MD 研究者養成コース四大学コンソーシアムリトリート
  • 発表場所: ホテルプラザ神戸（兵庫）
  • 年月日: 20131130-20131130
  • 招待講演
• [学会発表] 『時間』の生命科学 (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 大阪医科大学 内科学I 紫水会 特別講演
  • 発表場所: 大阪医科大学（大阪）
  • 年月日: 20131117-20131117
  • 招待講演
• [学会発表] 体内時刻測定法について (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第20回日本時間生物学会
  • 発表場所: 近畿大学（大阪）
  • 年月日: 20131109-20131110
  • 招待講演
• [学会発表] 個体システムの「時間」の理解に向けて (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: IGERグリーン自然科学レクチャー
  • 発表場所: ES総合館 ESホール (名古屋)
  • 年月日: 20131101-20131101
  • 招待講演
• [学会発表] Systems and Synthetic Biology of Biological Timings (2013)
  • 著者名/発表者名: 上田泰己
  • 学会等名: 第51回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 国立京都国際会館(京都)
  • 年月日: 20131028-20131030
  • 招待講演