| 研究課題/領域番号 |
25221004
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上田 泰己 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (20373277)
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| 研究分担者 |
洲崎 悦生 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (10444803)
大出 晃士 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40612122)
田井中 一貴 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (80506113)
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| 研究期間 (年度) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| キーワード | 概日振動 / リン酸化 / 温度補償性 / 自律発振機構 / 変異マウス作製 |
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| 研究実績の概要 |
昨年までの研究からリン酸化酵素CKIδ/εの基質リン酸化速度が試験管内での酵素－基質アッセイでは、温度に依存しないことを説明するモデルとして、温度依存的にリン酸化産物と酵素の結合が安定化し反応律速段階となることを提唱し、さらにその結合を担う残基候補として細胞を用いたスクリーニング系からCKIδ の責任アミノ酸残基を同定した。本年度は、この残基の変異導入によって、実際にリン酸化産物との親和性が低下するのみならず、この変異導入によって、試験管内でのリン酸化速度についての温度非依存性が崩れることを確認した。これらのことから、試験管内では提唱した温度補償性のモデルが現象をよく説明することが裏付けられ、さらに特定のアミノ酸残基によって、リン酸化基質と酵素の結合が調整されうることが示唆された。
また、分子レベルの知見から得られた概日周期調節に重要な役割を果たす因子の個体レベルでの行動周期調節に果たす役割を検証するために、高効率に変異概日時計遺伝子をノックインし、速やかに行動周期を測定する実験スキームを確立した。続いて、試験管内でのリン酸化温度補償性の崩れが、生体内での概日時計周期長制御に与える影響を調べるために、上述した責任アミノ酸残基に変異を導入したCKIδ をノックインしたマウス系統を作出した。これまでに行ってきた行動周期長観測に加えて、このマウスから脳組織レベルで概日周期長を測定するための長期培養系をセットアップした。これにより、単純な行動周期長のみならず、培養温度を変化させた際の組織レベルでの概日周期長変化を正確に測定できるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分子レベルでのリン酸化反応温度補償性について、これまでの研究で提示した動作モデルを裏付ける結果を得ていること、さらに、組織・個体レベルでの機能解析へ向けた変異マウスの作出、およびそのマウスに由来する組織レベルでの定量解析系のセットアップが計画通り進んでいることを鑑みて、予定通りの進行と評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画最終年度であるため、これまでの結果から得られたCKIδ/εによる温度非依存性のリン酸化速度を達成するモデルの構成的な証明および、個体内での概日周期長制御におけるその意義の解明に注力する。生化学的には、CKI以外のリン酸化酵素に対して、リン酸化産物に結合する性質を付与することで、温度非依存的なリン酸化速度が再現されるかどうかを調べることで、提唱する作動モデルの構成的な検証を行う。個体レベルでの表現型解析としては、本年度作出したK224変異CKIδノックインマウスを用いて、個体行動の周期性に与える影響を引き続き解析するとともに、および、それを担う中心的な組織である脳内の視交叉上核の概日周期性に与える影響を、特に培養温度条件変化に対して測定する。
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