プロテアソームの動態と機能制御機構の解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25221102
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 村田 茂穂 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (20344070)
• 研究期間 (年度): 2013-05-31 – 2018-03-31
• キーワード: プロテアソーム / ユビキチン / タンパク質分解 / タンパク質恒常性

研究実績の概要

下記1-4の項目について研究を行った。
1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明：出芽酵母プロテアソーム転写因子Rpn4の新たな認識コンセンサス配列の同定に成功した。またsiRNAスクリーニングにより哺乳類細胞におけるNrf1活性化に働くプロセシング酵素の同定に成功した。
2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解：胸腺プロテアソームは他のプロテアソームには作り出せないユニークな特徴を持つペプチド断片を切り出してMHCクラスI上に提示させることにより、T細胞の正の選択に働くことを明らかにした。
3.プロテアソームの細胞内動態の解析：プロテアソームの2つのユビキチン鎖受容サブユニットRpn10とRpn13の単独および二重欠損マウスの解析により、両者が主に縮重的に働いているが、一部タンパク質については各受容体特異的に分解されており、各々マウスの発生に必須であることを明らかにした。プロテアソーム新規会合因子としてSirt1を同定し、タンパク質品質管理に働いていることを明らかにした。プロテアソーム会合因子Proteasome Inhibitor 31-kDa (PI31)がin vivoではプロテアソームによるタンパク質分解を正に制御することを明らかにした。
4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析：ミトコンドリア機能異常による増殖遅延がプロテアソーム機能低下により回復すること、分解を免れ蓄積したMia40の作用によりミトコンドリアの融合と膜電位が改善する分子機構を明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初の目標に向けて順調に研究が進展している。
1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明：出芽酵母プロテアソームの基礎発現・誘導性発現両者を制御する転写因子Rpn4の新たな認識配列および標的分子群を同定することが出来た。また、哺乳類細胞を用いたsiRNAライブラリースクリーニングにより、誘導性発現を担うNrf1の活性化因子を世界に先駆けて同定することに成功したことは目標の1つをクリアする進展といえる。
2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解：分子多様性の病態生理的意義に関して、胸腺プロテアソームによる免疫制御分子機構の解明など、重要な成果をあげており、極めて順調に研究が進行している。これらの成果を受け、さらに一歩踏み込んだ「プロテアソームを自在にex vivoで再構成する」技術の開発にも取りかかったところである。
3.プロテアソームの細胞内動態の解析：がん治療の標的として注目を浴びているユビキチン鎖受容体Rpn13の欠損マウスの解析により、生体におけるRpn13の役割を明らかにした。また機能未知であったプロテアソーム会合因子Sirt1とPI31がタンパク質分解に与える影響についての成果など、順調に研究が進展している。プロテアソームの局在制御については、siRNAスクリーニングの実施を完了し、有力候補を得ている段階であり、予定通りに研究が進展している。
4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析：酵母遺伝学を用いてミトコンドリア機能とプロテアソーム機能の機能的相関の一端を明らかにすることが出来た。プロテアソーム機能低下時に発動する機構の解明のために、siRNAスクリーニングを実施済みであり、現在有力候補分子について分子機構を探索中であり、順調に研究が進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

1.プロテアソームサブユニットの転写を制御する機構の解明：新規に同定したNrf1プロセシング酵素がNrf1特異的にプロテアソーム機能低下時にのみ働く分子メカニズムを明らかにする。また、プロテアソーム基質ZsGreen-ODCの蛍光強度を指標としたsiRNAスクリーニングおよび酵母ワンハイブリッド法によるスクリーニングにより有力転写因子を同定済みであり、分子機構、生理的意義を明らかにする。
2.プロテアソームの分子集合機構の解明とその病態生理的意義の理解：ZsGreen-ODCの蛍光を指標としたsiRNAスクリーニングヒット中にさらなる分子集合因子が存在する可能性があり探索を進める。またES細胞では特殊な分子集合経路が存在することが示唆されていることから、ES細胞を用いたsiRNAスクリーニングを模索する。出芽酵母内に20遺伝子を同時に発現させる系を樹立できたので、プロテアソームの再構成を試みる。
3.プロテアソームの細胞内動態の解析：蛍光タグ付加プロテアソームサブユニットノックイン細胞を用いたsiRNAスクリーニングが完了し、核局在を制御する有力分子の同定に成功したところであり、分子機構および生理的意義の解明を進めていく。
4.プロテアソーム機能低下により惹起される病態生理の解析：プロテアソーム機能低下時に細胞の生存を回復または悪化させることを指標としたsiRNAスクリーニングを実施済みであり、プロテアソーム機能低下を代償する分子機構、プロテアソーム機能低下時に細胞死に至らしめる分子機構についての解明を目指す。

研究成果

• [国際共同研究] Ottawa Hospital Research Institute(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: Ottawa Hospital Research Institute
• [国際共同研究] Cincinnati Children's Hospital/National Cancer Institute(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Cincinnati Children's Hospital/National Cancer Institute
• [雑誌論文] Proteasome Impairment Induces Recovery of Mitochondrial Membrane Potential and an Alternative Pathway of Mitochondrial Fusion (2015)
  • 著者名/発表者名: Shirozu R, Yashiroda H, Murata S
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Biology 巻: 36 ページ: 347-362
  • DOI: 10.1128/MCB.00920-15
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Takada K, Van Laethem F, Xing Y, Akane K, Suzuki H, Murata S, Tanaka K, Jameson SC, Singer A, Takahama Y
  • 雑誌名: Nature Immunology 巻: 16 ページ: 1069-1076
  • DOI: 10.1038/ni.3237
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Redundant Roles of Rpn10 and Rpn13 in Recognition of Ubiquitinated Proteins and Cellular Homeostasis (2015)
  • 著者名/発表者名: Hamazaki J, Hirayama S, Murata S
  • 雑誌名: PLoS Genetics 巻: 11 ページ: e1005401
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005401
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Sirt1-deficiency causes defective protein quality control (2015)
  • 著者名/発表者名: Tomita T, Hamazaki J, Hirayama S, McBurney MW, Yashiroda H, Murata S
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 12631
  • DOI: 10.1038/srep12613
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Muscle Segment Homeobox Genes Direct Embryonic Diapause by Limiting Inflammation in the Uterus (2015)
  • 著者名/発表者名: Cha J, Burnum-Johnson KE, Bartos A, Li Y, Baker ES, Tilton SC, Webb-Robertson BJ, Piehowski PD, Monroe ME, Jegga AG, Murata S, Hirota Y, Dey SK
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 290 ページ: 15337-15349
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.655001
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The thymic cortical epithelium determines the TCR repertoire of IL-17-producing γδT cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Nitta T, Muro R, Shimizu Y, Nitta S, Oda H, Ohte Y, Goto M, Yanobu-Takanashi R, Narita T, Takayanagi H, Yasuda H, Okamura T, Murata S, Suzuki H
  • 雑誌名: EMBO Reports 巻: 16 ページ: 638-653
  • DOI: 10.15252/embr.201540096
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of minimum Rpn4-responsive elements in genes related to proteasome functions. Shirozu R, Yashiroda H, *Murata S (2015)
  • 著者名/発表者名: Shirozu R, Yashiroda H, Murata S
  • 雑誌名: FEBS Letter 巻: 589 ページ: 933-940
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2015.02.025
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Thymoproteasomes produce unique peptide motifs for positive selection of CD8(+) T cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Sasaki K, Takada K, Ohte Y, Kondo H, Sorimachi H, Tanaka K, Takahama Y, Murata S
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 6 ページ: 7478
  • DOI: 10.1038/ncomms8484
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] N-terminal α7 deletion of the proteasome 20S core particle substitutes for yeast PI31 function (2015)
  • 著者名/発表者名: Yashiroda H, Toda Y, Otsu S, Takagi K, Mizushima T, Murata S
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Biology 巻: 35 ページ: 141-152
  • DOI: 10.1128/MCB.00582-14
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] プロテアソームの多様性と生体制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 村田茂穂
  • 学会等名: 第32回高峰カンファレンス
  • 発表場所: 如水会館（東京都千代田区）
  • 年月日: 2016-03-11 – 2016-03-11
  • 招待講演
• [学会発表] プロテアソームの多様性による生体制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 村田茂穂
  • 学会等名: 第4回CAKIカンファレンス
  • 発表場所: リーガロイヤルホテル広島（広島県広島市）
  • 年月日: 2016-01-09 – 2016-01-09
  • 招待講演
• [学会発表] プロテアソームの多様性と生体制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村田茂穂
  • 学会等名: 第7回免疫適塾
  • 発表場所: スターツ総合研修センター（茨城県つくばみらい市）
  • 年月日: 2015-07-05 – 2015-07-06
  • 招待講演
• [学会発表] 胸腺プロテアソームによるT細胞正の選択の新しい機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村田茂穂
  • 学会等名: 平成27年度日本生化学会関東支部例会/第56回新潟生化学懇話会
  • 発表場所: 新潟日報メディアシップ（新潟県新潟市）
  • 年月日: 2015-06-20 – 2015-06-20
  • 招待講演
• [備考] 東京大学大学院薬学系研究科蛋白質代謝学教室ホームページ
  • URL: http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~tanpaku/