| 研究課題/領域番号 |
25242068
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
藤井 郁雄 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70189984)
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| 研究分担者 |
円谷 健 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00372855)
藤原 大佑 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (30611420)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 生体分子 / 医療・福祉福祉 / ナノバイオ / 蛋白質 / 有機化学 |
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| 研究概要 |
研究目的：進化分子工学（細胞表層ディスプレイ技術）とペプチド構造構築理論を組み合わせることにより，分子標的化合物の新しい設計法を開発する。すなわち，強固な立体構造をもつペプチド（ヘリックス構造など）の細胞表層提示ライブラリーを構築し，標的タンパク質に結合するペプチド（マイクロ抗体と呼ぶ）をスクリーニングする。得られるペプチドは立体構造を持っているので，結合活性アミノ酸（ファーマコフォア）の空間配置を容易に決定することができる。そこで，この立体構造情報をもとに分子標的化合物を設計する。
研究計画・方法：本研究では，ヘリックス－ループ－ヘリックス構造ペプチドを土台分子として，４つの戦略で分子標的化合物の作製技術を検討する。①試験管内進化によるマイクロ抗体の開発，②立体構造情報に基づくマイクロ抗体の開発，③親和性，生物活性，生体内での安定性，膜透過性，体内動態，抗原性： ④分子標的低分子化合物の設計と合成および生物活性
平成25年度の研究実績概要：当該年度は，①試験管内進化によるマイクロ抗体の開発を行った。さまざまなタンパク質－タンパク質相互作用のトポロジーを考慮し，α-ヘリックス部分のライブラリー以外に，ヘリックス＋ループ部分ライブラリーを作製した。本ライブラリーをファージ表層上に提示させファージライブラリーを構築したのち，本ライブラリーを用いて血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対してバイオパンニングを行い，高結合活性の抗VEGFマイクロ抗体の獲得に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)立体構造規制ペプチドライブラリーの構築：さまざまなタンパク質－タンパク質相互作用のトポロジーを考慮し，α-ヘリックス部分のライブラリー以外に，ヘリックス＋ループ部分ライブラリー(α-helix+loop)を構築した。C末端ヘリックスに位置する6残基のアミノ酸と11残基のループの9残基をランダム化し，さらにN末端とC末端にシステイン残基を導入しジスルフィド結合を形成するマイクロ抗体ライブラリー (ΔPTA-6Rloop11-C) を作製した。
(2) 立体構造規制ペプチドライブラリーのスクリーニング：ΔPTA-6Rloop11-CライブラリーをM13ファージ表層に提示させたファージライブラリーを用いて血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対してバイオパンニングを行い，結合性ペプチドのスクリーニングを行った。ストレプトアビジン修飾磁気ビースを使用し、ビオチン化VEGFと結合しているファージを回収した。バイオパンニングは４ラウンド行った。3ラウンドのバイオパニングで回収されたファージの塩基配列を解析したところ，ループ部位に3種類のコンセンサス配列を観測した。
3) 立体構造規制ペプチド(マイクロ抗体)の結合活性：ファージミドベクターよりペプチドをコードする遺伝子を切り取り、３種のチオレドキシン融合ペプチド(Trx-41, Trx-42, Trx-49)を作製した。これら融合ペプチドの解離定数 (Kd) は表面プラズモン共鳴法で測定した。その結果，いずれの融合ペプチドもVEGFに対して高い結合活性を示し，特異的に結合することが明らかとなった(Kd値Trx-41: 602 nM, Trx-42: 333 nM, Trx-49: 0.67 nM)。さらに，VEGF－受容体相互作用の阻害活性を行ったところ，いずれのペプチドもVEGFとその受容体との結合を阻害することが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では，ヘリックス－ループ－ヘリックス構造ペプチドを土台分子として，４つの戦略で分子標的化合物の作製技術を検討する。今後は，以下の３つの研究課題について検討する。
②立体構造情報に基づくマイクロ抗体の開発：X線構造から得られる立体構造情報をもとに，分子認識に必要なアミノ酸残基を土台分子に移植することにより，目的のマイクロ抗体を取得する。
③親和性，生物活性，生体内での安定性，膜透過性，体内動態，抗原性：生体内（血清中など）での安定性,細胞膜透過性や抗原性および生物活性（細胞試験）について検討する。
④分子標的低分子化合物の設計と合成および生物活性：ペプチド（マイクロ抗体）の立体構造から得られる活性アミノ酸残基の３次元構造情報をもとに分子標的低分子化合物の設計し，合成して生物活性を検討する。
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