研究課題
基盤研究(A)
本研究の目的は、染色体でのゲノムDNAの相同組換え機構を解明することである。真核生物では、ゲノムDNAはクロマチンとして収納されているが、高次に折りたたまれたクロマチンでの相同組換え機構についてはいまだ未解明である。本研究では、in vitroで再構成したクロマチンを用いた相同組換え反応系によって、クロマチンDNA 基質上での相同DNA 対合反応の分子機構を解析した。さらに、ミニクロモソームを利用したin vivo クロマチン解析を補完的に行うことによって、真核生物染色体ゲノムDNAにおける相同組換え反応の機構をクロマチンレベルで理解ことを目指した。本年度は、in vitro相同DNA 対合反応系を用いて、RAD51、RAD52、およびそれらの活性化因子HOP2-MND1複合体の機能解析を生化学的に行った。材料としては、イネ、出芽酵母、ヒトのタンパク質をリコンビナントとして精製したものを用いた。そして、それらの相同DNA対合反応の各ステップにおける機能や相互作用に関する情報を得た。それらの結果から、これらの相同組換えタンパク質の、相同DNA対合反応における機能モデルを提案した。並行して、クロマチンにおける相同DNA対合反応のin vitro系の構築を行った。クロマチンの構成タンパク質であるヒストンH2A、H2B、H3、およびH4をリコンビナントとして精製し、相同DNA組換えのドナー基質となる二重鎖DNA上にポリヌクレオソームを再構成する系を確立した。本研究によって、相同DNA対合反応の基質として優れたポリヌクレオソームが再構成系によって得られることが分かった。また、出芽酵母ミニクロモソームを用いて、ヌクレオソーム形成におけるDNA配列依存性を検討した。
1: 当初の計画以上に進展している
相同組換え反応の生化学的解析は、ヒトのタンパク質を中心に研究が進められてきた。しかし、それらの性質は必ずしも生化学実験に適しているとは言えず、そのため研究が立ち後れていた。これらの問題を解決するために、本年度では、研究材料をイネや出芽酵母に広げ、それら由来の相同組換えタンパク質を精製して相同組換えの部分反応を解析する系の確立に成功した。また当初の目的どおり、再構成クロマチンによる相同組換え反応のin vitro系の構築も順調に進んでいる。これらの成果は当初の計画を上回るものであり、相同組換えの中心反応である、相同DNA対合過程の分子機構解明に重要な知見を与えた。従って、本年度の研究は計画以上に進展していると考えられる。
ヒトの相同組換えタンパク質の解析と並行して、新たに研究対象として確立したイネなどの相同組換えタンパク質を加えて、クロマチンでの相同組換え反応解析系やin vivo解析系を利用して、それらの機能の解析を行う。また、それらの結晶化を行い、並行して構造生物学的アプローチを展開することで、いまだ未解明の相同組換えステップのメカニズムの解明を目指す。
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