| 研究課題/領域番号 |
25251009
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中川 敦史 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20188890)
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| 研究分担者 |
岩崎 憲治 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (20342751)
一木 珠樹 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (70355501)
宮崎 直幸 生理学研究所, 大学共同利用機関等の部局等, 研究員 (00634677)
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| 研究期間 (年度) |
2013-05-31 – 2016-03-31
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| キーワード | ウイルスの細胞内動態 / 分子認識および相互作用 / クライオ電子顕微鏡 / 電子顕微鏡トモグラフィー / Ｘ線結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
平成25年度は以下の研究を行った．
1.ウイルス粒子の構造解析 P2 蛋白質を有したRDV 粒子については，結晶化条件の検討を進めたが結晶を得ることはできていない．一方，クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による低分解能構造解析により，５回軸周りにP2蛋白質と思われる構造を観察することができた．この構造はP2蛋白質のおよそ半分の体積を持つと考えられる．このことと，単独で発現させたP2蛋白質の電子顕微鏡による観察でP2がほぼ中央付近で大きく折れ曲がる構造を示すことから，P2がウイルス表面に柔軟な突起構造を作り，昆虫の細胞と相互作用するモデルが考えられる．この成果は現在論文としてまとめている．RGDV 粒子に関しては，大量調製の条件検討を進めたが，構造解析に十分は収量は得られていない．
２．ウイルス各蛋白質の大量調製及び構造解析 RDVのバイロプラズマ構成蛋白質Pns12の結晶構造解析を，セレノメチオニン置換体を利用した多波長異常分散法や重原子同形置換法により進めたが，現時点で位相問題の解決に至っていない．重原子同形置換体のスクリーニングと平行して，電子顕微鏡による低分解能構造を基にした分子置換法を適用するために，電子顕微鏡観察を行った．現在２次元平均構造の取得を進めており，その後に３次元モデル構築と分子置換法を行う予定である．それ以外のウイルス蛋白質についても，平行して発現系の構築を進めている．
３．ウイルスの細胞内動態の解析 クライオ電子顕微鏡トモグラフィーによりウイルスを感染させた細胞の観察を行い，昆虫細胞および植物細胞内での局在および感染過程の観察に成功し，論文に報告した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
クライオ電子顕微鏡トモグラフィーによる感染細胞観察が順調に進展し，成果をあげることができた．H26年度以降，さらに時間軸を加えた解析を進めることで，当初計画の達成を目指す．一方，P2を保持したウイルス粒子の結晶化に難航しているが，クライオ電子顕微鏡を用いることで構造情報を得ることができた． P2を欠損したウイルス粒子については１つの結晶から4A以上の分解能のフルデータセットの収集に成功した．2.7A以上の分解能の回折像は得られているので，より大きな結晶が得られれば，高分解能データ収集は可能と考えている．今後電子顕微鏡による高分解能構造解析も視野に入れて，計画の遂行を目指す．RDV由来のPns12蛋白質のネイティブデータ収集は終了し，構造解析を進めている．以上の理由により，「おおむね順調に進展している」とした．
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度より新たな研究員および学生２名をプロジェクトに加え，Pns12，P7のＸ線結晶構造解析を中心に，ウイルス蛋白質の構造解析を加速させる．電子顕微鏡に関しては，時間軸を加えた解析を積極的に進める．P2を保持したウイルス粒子についてはクライオ電子顕微鏡を用いた解析とともに，P2単体の構造解析を進め，その結果と合わせることで．全体像の解明を目ざす．P2を欠損したウイルス粒子については，高分解能データ収集を目指してより大きな結晶の作製を進めるとともに，高分解能データが得られるデータ処理法を検討する．
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