研究課題
(1）Kinase-interacting substrate screening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング（担当：貝淵、天野）：当研究室で開発した質量分析を用いたin vitro基質スクリーニング法であるKISS法により、細胞の極性化関連キナーゼLKB1、MARK1について基質の網羅的スクリーニングを行った。結果、LKB1、MARK1についてそれぞれ52、45の基質を同定した。(2）Phosphatase Inhibitor and Kinase Inhibitor Substrate Screening (PIKISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング(担当：貝淵、西岡)：当研究室で開発された質量分析を用いたin vivo基質スクリーニング法であるPIKISS法による基質スクリーニングを行った。昨年度行ったaPKC基質候補探索に引き続き、極性化時のPKCによる細胞骨格の制御に関与する基質スクリーニングを行い、257のPKC基質候補を得た。(3）新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当：貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田)： KISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子のリン酸化抗体に関しては、Kif2A Ser135、Ser135/137抗体を新たに精製し、Tiam1 Ser29のモルモット由来抗体を新たに作成した。これらKif2A Ser135、Ser135/137 、Tiam1 Ser29、CLASP2 Ser940を用いて細胞極性化時のリン酸化のモニタリングを行った。(4）新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当：貝淵、天野、黒田、中牟田)： 極性関連基質候補Tiam1、CLASP、KIF2a等についてはリン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製し、上述したリン酸化抗体と併用して細胞内局在の顕微観察及び機能解析を行った。
2: おおむね順調に進展している
(1）Kinase-interacting substrate screening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング（担当：貝淵、天野）： KISS法による極性化関連キナーゼLKB1、MARK1についての基質の網羅的スクリーニングは、基質候補を得るとともに一部基質リン酸化の確認を開始するなど、順調に進行している。(2）Phosphatase Inhibitor and Kinase Inhibitor Substrate Screening (PIKISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング(担当：貝淵、西岡)： PIKISS法による極性化時のPKCによる細胞骨格の制御に関与する基質スクリーニングも、細胞刺激条件の決定が完了し、ついでスクリーニングを行い多数のPKC基質候補を得ることに成功するなど順調に進行している。(3）新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当：貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田)： KISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子のリン酸化抗体に関しては、作成、精製した抗体の感度・特異性はその後の研究用の使用に耐えるものであることの確認ができ、抗体を使用した研究も順調に進行している。(4）新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当：貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田)： 極性関連基質の変異蛋白質の発現・精製は順調であり、上述したリン酸化抗体を併用した機能解析実験も順調に進行している。
(1）Kinase-interacting substrate screening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング：当研究室で開発したアフィニティカラム上のキナーゼ基質複合体を基質リン酸化反応後、LC-MS/MSにより多数の基質とそのリン酸化サイトを決定する方法(KISS法)によるPAK1等の極性関連キナーゼのスクリーニングを行う。aPKC、MARK1等の得られた基質候補数が少ないものについて、キナーゼタンパク質や反応条件の改変により更なる基質候補分子の同定を行う。(2）Phosphatase Inhibitor and Kinase Inhibitor Substrate Screening (PIKISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング：当研究室で開発されたホスファターゼ阻害剤とキナーゼ阻害剤を組み合わせ細胞内におけるキナーゼの基質をスクリーニングする方法(PIKISS法)により、極性関連キナーゼaPKCの基質の更なる解析及び、PAK、Cdk5、 AMPK、GSK3beta等の基質の網羅的スクリーニングを行う。(3）新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング：昨年度までの基質スクリーニングで得られた基質候補について、免疫沈降後のリン酸化ペプチドの質量分析によりリン酸化の変動をモニターする。同時に生理的に重要と予想される蛋白質のリン酸化部位についてリン酸化抗体作製に着手する。(4）新規基質の生理機能・制御機構の解析：基質候補について、in silicoにてパスウェイ解析を行い、シグナルネットワーク内の役割を検討する。また、リン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製し、細胞内局在の顕微観察及び機能解析を行う。細胞において基質蛋白質の機能抑制、変異型遺伝子による機能回復実験を行うことで、極性形成過程におけるリン酸化シグナルの生理的意義を調べる。
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