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陸上植物の主たる窒素源である硝酸イオンは遺伝子発現パターンを変化させ、様々な応答を引き起こすシグナル分子としても働く。このような硝酸シグナル応答を担う鍵転写因子として同定したNLP転写因子を手掛かりに、硝酸シグナル応答の全容の解明を目指して解析を行った。昨年度までの解析により、NLPのリン酸化がNLPの活性化に重要であることが示唆されたが、これまで、硝酸応答に重要な領域におけるリン酸化が確認できていなかった。そこで、MYCエピトープタグを付加したNLPを発現しているシロイヌナズナ懸濁培養細胞と抗MYC抗体を用いた免疫沈降によってNLPタンパク質を調整し、リン酸化に加えて他の翻訳後修飾も起こることを前提にしたLC/MS/MS解析を行うことで、NLPの硝酸シグナル応答領域中のアミノ酸残基にリン酸化が起こっていることを確認した。次に、アンモニウム塩のみを用いた水耕栽培によって生育させたシロイヌナズナからプロトプラストを調製し、そのプロトプラストを用いた一過的発現系によって効率的に硝酸応答を解析することができる実験系を確立した。この実験系を用いて、LC/MS/MS解析によって同定されたリン酸化部位に変異を導入するとNLPが活性を失うことを確認した。また、抗MYC抗体を用いた免疫沈降を行った時にNLPと共免疫沈降してくるシロイヌナズナタンパク質の解析も行った。これにより、幾つかのタンパク質が同定されたことから、これらの詳細な解析を開始した。さらに、トランスクリプトーム解析によって、NLPは硝酸誘導型の発現を行う遺伝子の多くを制御していることが示唆されていたので、このことを確立するための解析も実施した。トランスクリプトーム解析によってNLPの標的遺伝子であることが示唆されたBT遺伝子のプロモーターに対するNLPの効果を調べ、NLPがBT遺伝子プロモーターを直接的に制御していることを明らかにした。
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