機能性ＲＮＡの微生物生産およびＲＮＡ発現菌の利用

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25252017
• 研究機関: 豊橋技術科学大学
• 研究代表者: 菊池 洋 豊橋技術科学大学, 研究推進アドミニストレーションセンター, 特命教授 (40273320)
• 研究分担者: 梅影 創 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (30419436) ; 大山 隆 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (60268513) ; 青木 宙 早稲田大学, ナノ・ライフ創新研究機構, 招聘研究員 (00051805)
• 研究期間 (年度): 2013-10-21 – 2016-03-31
• キーワード: 発酵 / 核酸 / 応用微生物学 / RNA生産 / RNAドラッグ

研究実績の概要

近年のRNAの新しい機能に関する基礎研究の進展はめざましく、特に非コードRNA（ncRNA）があらゆる生物の生命活動の制御を担っていることが明らかになってきた。そのことから、うまくデザインされたRNAは遺伝子発現を制御する薬としても期待されている。ただ、RNA生産には膨大なコストがかかる。本研究は、生産の圧倒的低コスト化をはかるための微生物によるRNA生産技術開発を目的としている。昨年度まで、大腸菌を用いるRNA生産系で世界一の収量を達成したり、海洋性細菌Rhodovulum sulfidophilumが細胞外に核酸を生産する性質を利用してRNAアプタマーやショートヘアピンRNA（shRNA）の細胞外生産に成功するなどの成果を上げてきた。
生産の中心となる宿主菌であるR. sulfidophilumの安全性を確保する上で、本菌の生理学的性質や全ゲノムの解析は極めて重要であるため、最終年度の本年度は、当初の計画通り、これらの実験研究を推進した。まず、本菌の細胞外核酸生産が制御されているクォーラムセンシング（quorum sensing）機構に関する解析を行い、本菌のオートインデューサーはアシル鎖長がC20である新規なN-Acyl homoserine lactonであることを明らかにした。
さらに、次世代シークエンサー454 GS FLX+（Roche）およびMiSeq（Illumina）を用いて本菌のゲノムDNAの全塩基配列を決定し解析を行った。また、本菌の詳細な網羅的遺伝子発現解析も行った。RNA生産の上で本菌には有害な遺伝子は存在しないことが明らかになった。
また、一方で、本年度も、生産性を上げるための努力も行い、細胞外RNA生産量が約1.7倍増産する変異株を作成した。以上、本年度までの本研究で、細菌生理学上の様々な新発見と共に微生物を用いる全く新しいRNA生産技術が開発された。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Complete genome sequence of cyanobacterium Geminocystis sp. NIES-3708, which performs type II complementary chromatic acclimation (2015)
  • 著者名/発表者名: Hirose, Y., Katayama, M., Ohtsubo, Y., Misawa, N., Iioka, E., Suda, W., Oshima, K., Hanaoka, M., Tanaka, K., Eki, T., Ikeuchi, M., Kikuchi, Y., Ishida, M. and Hattori, M.
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 2015 3 ページ: e00357-15
  • DOI: 10.1128/ genomeA.00357-15
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Complete genome sequence of cyanobacterium Geminocystis sp. NIES-3709 that harbors phycoerythrin-rich phycobilisome (2015)
  • 著者名/発表者名: Hirose, Y., Katayama, M., Ohtsubo, Y., Misawa, N., Iioka, E., Suda, W., Oshima, K., Hanaoka, M., Tanaka, K., Eki, T., Ikeuchi, M., Kikuchi, Y., Ishida, M. and Hattori, M.
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 2015 3 ページ: e00385-15
  • DOI: 10.1128/genomeA.00385-15
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Complete genome sequence of Rhodovulum sulfidophilum DSM 2351, an extracellular nucleic acids producing bacterium (2015)
  • 著者名/発表者名: Nagao, N., Hirose, Y., Misawa, N., Ohtsubo, Y., Umekage, S., and Kikuchi, Y.
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 2015 3 ページ: e00388-15
  • DOI: 10.1128/genomeA.00388-15
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Improved bioassay for detecting autoinducer of Rhodovulum sulfidophilum (2015)
  • 著者名/発表者名: Terada, T., Kikuchi, Y., and Umekage, S.
  • 雑誌名: AIP Conference Proceedings 巻: 1649 ページ: 67-70
  • DOI: 10.1063/1.4913546
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Abnormal rapid non-linear RNA production induced by T7 RNA polymerase in the absence of an exogenous DNA template (2015)
  • 著者名/発表者名: Kakimoto, Y., Fujimuma, A., Fujita, S., Kikuchi, Y., and Umekage, S.
  • 雑誌名: AIP Conference Proceedings 巻: 1649 ページ: 113-115
  • DOI: 10.1063/1.4913554
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Evidence for RNA template-directed elongation (2015)
  • 著者名/発表者名: Kakimoto, Y., Fujimuma, A., Sakamoto, T., Kikuchi, Y. and Umekage, S.
  • 雑誌名: AIP Conference Proceedings 巻: 1649 ページ: 116-120
  • DOI: 10.1063/1.4913555
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Functional analyses of carnivorous plant-specific amino acid residues in S-like ribonucleases (2015)
  • 著者名/発表者名: Arai, N., Nishimura, E., Kikuchi, Y., and Ohyama, T.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 465 ページ: 108-112
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.07.139
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The gene transfer agent-like particle of the marine phototrophic bacterium Rhodovulum sulfidophilum (2015)
  • 著者名/発表者名: Nagao, N., Yamamoto, J., Komatsu, H., Suzuki, H., Hirose, Y., Umekage, S., Ohyama, T., and Kikuchi, Y.
  • 雑誌名: Biochemistry and Biophysics Reports 巻: 4 ページ: 369-374
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2015.11.002
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Emergence of RNA self-replication cycle through RNA template-directed RNA polymerisation by DNA dependent RNA polymerase (2015)
  • 著者名/発表者名: Kakimoto Y., Fujinuma A., Kikuchi Y. and Umekage S.
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015
  • 発表場所: Honolulu, USA（アメリカ合衆国）
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会
• [学会発表] Agarose binding RNA aptamer (2015)
  • 著者名/発表者名: Umekage S. and Kikuchi Y.
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015
  • 発表場所: Honolulu, USA（アメリカ合衆国）
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会
• [学会発表] RNAの凝集化が引き起こすRNA安定化によるRNAワー ルド仮説の補強 (2015)
  • 著者名/発表者名: 梅影創、菊池洋
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会（BMB 2015）
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] RNA分解酵素耐性を示す天然型RNA配列の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤沼輝、柿本恭宏、坂本泰一、菊池洋、梅影創
  • 学会等名: 第17回日本RNA学会年会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2015-07-15 – 2015-07-17
• [学会発表] DNA鋳型依存的RNAポリメラーゼによるRNA鋳型依存的なRNA合成反応は急激なRNAの増幅を引き起こす (2015)
  • 著者名/発表者名: 柿本恭宏、藤沼輝、菊池洋、梅影創
  • 学会等名: 第17回日本RNA学会年会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2015-07-15 – 2015-07-17
• [学会発表] 環状RNAと直鎖状 RNA を分離する方法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 黒木 大海、菊池 洋、梅影 創
  • 学会等名: 第17回日本RNA学会年会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2015-07-15 – 2015-07-17
• [学会発表] Enhanced floc forming mutants of Rhodovulum sulfidophilum obtained by UV mutagenesis (2015)
  • 著者名/発表者名: Umekage, S., Noda,A., and Kikuchi, Y.
  • 学会等名: FEMS 2015
  • 発表場所: Maastricht, The Netherlands（オランダ）
  • 年月日: 2015-06-07 – 2015-06-11
  • 国際学会
• [備考] 豊橋技術科学大学教員の研究紹介
  • URL: http://www.tut.ac.jp/university/faculty/rac/362.html
• [産業財産権] 偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤 (2016)
  • 発明者名: 梅影創、菊池洋
  • 権利者名: 豊橋技術科学大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-028988
  • 出願年月日: 2016-02-03