研究課題
ゲノムリプログラミングを調節する因子の探索を目的として、その転写産物が母性mRNAとして受精前の卵に大量に蓄積され、かつ卵特異的に発現する遺伝子に着目して研究を行うことを計画した。本年度は、特にクロマチン構造に着目し、その調節因子に関する探索を行った。まず、ゲノム全体のクロマチン構造を解析するため、GFPタグを付加したヒストンH2Bを卵、あるいは初期胚に強制発現させ、fluorescent recovery after photobleaching（FRAP）法を行った。その結果、全能性を有する1細胞期胚では、他のステージの着生前初期胚あるいはES細胞に比べて極端にクロマチン構造が緩くなっていることが明らかとなった。このクロマチン構造が緩い状態と全能性の関連を調べるため、体細胞核を移植した胚を用いてFLAP解析を行ったところ、移植後に著しくクロマチン構造が緩むことが明らかとなった。また、受精後に発生が進むのに従ってクロマチン構造が次第に締まっていくことが分かった。さらに、最終分化していると考えられる成長卵において、クロマチン構造は1細胞期胚よりは締まっているものの、他の発生時期の胚に比べて緩んだ構造であることが明らかとなった。そこで、緩んだクロマチン構造に関与する因子として、CHD9ファミリーに着目した。このファミリーの中で特にCHD9が卵特異的に大量に発現していることから、この遺伝子をターゲットとしてCRISPR/Cas9システムでノックアウトマウスを作成した。そして、ノックアウトマウスから得られた卵を用いてFRAP解析を行ったところ、ワイルドタイプに比べてクロマチン構造が締まっていることが明らかとなった。したがって、卵および受精直後の初期胚における緩んだクロマチン構造にCHD9が関与していることが明らかとなった。
2: おおむね順調に進展している
本年度の計画は、研究実績の項で記したように、ゲノムリプログラミングのメカニズムを明らかにするために、母性mRNAとして卵に蓄積されているものの中からリプログラミング因子を探索するというものである。その前提として、まずゲノムリプログラミングとクロマチン構造の関連を調べるためにFRAP解析を行い、緩んだクロマチン構造が関与していることを明らかにした。そして、クロマチン構造を緩くする因子としてCHD9を同定することができた。本研究計画では、リプログラミング因子の候補として、卵特異的に発現し母性mRNAとして卵に蓄積されるものをターゲットとすることにしたが、Chd9はこれらのクライテリアにしっかりと当てはまるものであり、リプログラミング因子の有力な候補を得ることができたものと考えられる。また、今後の更なるリプログラミング因子探索のために、poly-A鎖の長さによって母性mRNAを分画するシステムの改良を行い、これまでよりも正確に検出できる処方を確立した。以上、本研究プロジェクトは、ここまでの結果で十分な進展があったものと考えられる。
(1)CHD9のリプログラミングへの関与についての解析前年度までにCHD9が受精前後における緩いクロマチン構造に関与していることを明らかにしたが、実際にゲノムリプログラミングに関わっているかどうかを検証する。そのため、Chd9ノックアウトマウスから得られた卵および初期胚についてリアルタイムPCRあるいはRNAシーケンス解析を行い、実際に受精後の遺伝子発現リプログラミングに異常が起こっているかどうかを解析する。また、リプログラミングに関わると考えられているヒストン変異体の置換についても、Chd9ノックアウトマウスを用いた解析を行う。(2)受精後に動員される母性mRNAの網羅的探索による、リプログラミング因子候補の探索と同定。ゲノムリプログラミングに関わる遺伝子はChd9のみとは考え難いため、他の候補因子についてもさらなる探索を行う。すなわち、減数分裂再開を機に動員される母性mRNAの探索をpoly-A鎖伸長を指標とした実験により行い、リプログラミング因子の候補遺伝子を得る。そして、その候補について、実際にそれらがゲノムのリプログラミングに関与しているかどうかを確認するため、CRISPER/Casシステムによる遺伝子のノックアウトを行い、リプログラミングに関わる現象に変化が起こるかどうかを調べる。
すべて 2016 2015 その他
すべて 国際共同研究 (3件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 2件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件)
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