ジンクフィンガーヌクレアーゼの遺伝子ノックアウト動物作製への実用化に関する研究

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25252056
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 内藤 邦彦 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (20188858)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 人工ヌクレアーゼ / Cas9 / CRISPR / ブタ卵 / マウス卵 / 魚類卵

研究実績の概要

ブタ卵に対する検討では、GV特有のDNA形状やゲノム状態が変異導入に及ぼす影響を解析した結果、卵（4n）の変異導入アレル数は62％が1本、35％が2本と少なかった。これが減数分裂特異的かは確定できないが、成熟過程に導入された変異が必ずしも次世代へ反映されないことが示唆された。LMB処理GV期卵ではMII期卵に比べて長いindelが導入される傾向があり、脱凝縮した染色体は凝縮したものより大きな欠失が起こり易いと考えられた。
魚類卵に対する検討では、ヤマメ2尾に由来するF1の6.8%と13.3%の個体が、またニジマス2尾に由来するF1の1.7%と3.9%の個体がヘテロ変異体であり、これら同士を交配したF2では約1/4がノックアウト(KO)個体であった。したがって低率だが魚卵にもCRISPR/Cas系は有効で、変異は次世代に受け継がれることが示された。
ノックイン（KI）個体の作製に関しては、高濃度の二本鎖DNAによる発生停止のメカニズムについてDNA損傷応答の面から検討し、前核期のヒストン H2AXリン酸化がこの時に顕著に上昇する一方、その下流であるp53や着床前胚の発生進行に重要な胚性ゲノム活性化に影響は認められなかった。以上より、二本鎖DNAは受精卵にp53を介さないDNA損傷応答シグナルを活性化させることが示唆された。
これまで用いられStreptococcus Pyogenes (SP)由来のCRISPR/Cas系以外のPAM配列の異なるCRISPR/Cas系の有効性について、培養細胞でゲノム改変に使用可能と報告されているS．Thermophilus-1（ST1）のものが受精卵を用いたKOおよびKIマウスの作製に応用できるか検討し、変異導入が92％、KIが46％とSP同等の高率にゲノム編集が可能であることを示した。また、Campylobacter jejuni (Cj)由来のCRISPR/Cas系のPAM配列を検討し、5'-NNNVRYACでは80％前後の変異率が得られるが、これまでPAMとして使用可能と報告されている5’-NNNNACA、5’-NNNNRYAC、5’-NNNVRYMでは変異が導入できないことを示した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Contributions of UBE2C and UBE2S to meiotic progression of porcine oocytes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujioka YA, Onuma A, Fujii W, Sugiura K, Naito K.
  • 雑誌名: Juornal of Reproduction and Development 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1262/jrd.2018-006
• [雑誌論文] Chd9 mediates highly loosened chromatin structure in growing mouse oocytes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ooga M, Fuyana S, Hashioka Y, Fujii W, Naito K, Suzuki MG, Aoki F.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.04.105
• [雑誌論文] Efficient mutagenesis by CRISPR/Cas system during meiotic maturation of porcine oocytes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Onuma A, Fujii W, Sugiura K, Naito K.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 63 ページ: 45-50
  • DOI: 10.1262/jrd.2016-094
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Application of dead end-knockout zebrafish to recipients of germ cell transplantation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Li Q, Fujii W, Naito K, Yoshizaki G.
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 巻: 84 ページ: 1100-1111
  • DOI: 10.1002/mrd.22870
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Efficient generation of genome-modified mice using Campylobacter jejuni-derived CRISPR/Cas. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Ikeda A, Sugiura K, Naito K.
  • 雑誌名: International Jornal of Molecular Sciences 巻: 18 ページ: 2286
  • DOI: 10.3390/ijms18112286
• [雑誌論文] Zygote-mediated generation of genome-modified mice using Streptococcus thermophiles 1-derived CRISPR/Cas system. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Kakuta S, Yoshioka S, Kyuwa S,Sugiura K,Naito K.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 477 ページ: 473-476
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.06.070
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analyses of EMI functions on meiotic maturation of porcine oocytes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujioka YA, Onuma A, Fujii W, Sugiura K, Naito K.
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 巻: 83 ページ: 983-992
  • DOI: 10.1002/mrd.22738
  • 査読あり
• [学会発表] 生殖細胞欠損ニジマスの作出とその代理親魚への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原亮・片山直人・藤井渉・内藤邦彦・吉崎悟朗
  • 学会等名: 平成30年度公益社団法人日本水産学会春季大会
• [学会発表] 生殖細胞欠損ヤマメの作出とその代理親魚への応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤原 亮・片山直人・藤井 渉・内藤邦彦・吉崎悟朗
  • 学会等名: 平成29年度公益社団法人日本水産学会春季大会
• [学会発表] C. jejuni由来CRISPR/Casによるゲノム改変マウスの作製 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤井渉・池田有沙・杉浦幸二・内藤邦彦
  • 学会等名: 第123回日本畜産学会
• [学会発表] Involvement of Chd9 in highly loosened chromatin structure in growing oocytes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ooga M, Fujii W , Naito K, Aoki F.
  • 学会等名: International Symposium on “Epigenome Dynamics and Regulation in Germ Cells”
  • 国際学会