ゲノム編集技術を利用した極限的乾燥耐性遺伝子の同定と機能解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25252060
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 独立行政法人農業生物資源研究所
• 研究代表者: 黄川田 隆洋 独立行政法人農業生物資源研究所, 昆虫機能研究開発ユニット, 主任研究員 (60414900)
• 研究分担者: 山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / 乾燥耐性 / 昆虫 / バイオテクノロジー / オーミクス

研究概要

本研究の目的は、ネムリユスリカの乾燥無代謝休眠に決定的な役割を果たしていると考えられる原因遺伝子を含めた遺伝子ネットワークを同定した上で、その分子的背景を利用した乾燥感受性細胞の乾燥保存法の確立を目指すことにある。具体的には、人工的に作製した塩基配列認識型ヌクレアーゼを用いてゲノム上の標的遺伝子破壊やレポーター遺伝子の挿入などを可能にする技術である「ゲノム編集」を利用して、ネムリユスリカ培養細胞の乾燥耐性能を破壊することで、乾燥無代謝休眠の原因遺伝子を特定する。
当初、ゲノム編集技術としてTALENを利用する予定であったが、ネムリユスリカ培養細胞（Pv11細胞）での発現が認められず、よりシステムが簡易なCRISPR/Casに変更する決断を行った。CRISPR/Casシステムは人工的に設計したDNAを細胞に導入し、任意のタンパク質（Cas9）やRNA（guide RNA）を作らせることで作動するシステムである。元来原核生物で作動する生体防御システムを応用しているため、実験対象となる生物種のCodon usageやプロモーターを考慮したシステムの構築が必要となる。まず、ネムリユスリカのCodon usage に合わせたCas9をコードする人工遺伝子の構築を行った。さらに、Cas9とguide RNAを発現させるためのタンパク質発現プロモーター (Pol II) 領域と、RNA発現プロモーター (Pol III) 領域をネムリユスリカゲノムから単離した。これらプロモーターを用いた結果、Pv11細胞でCas9タンパク質とguideRNAの発現に成功した。この成果を踏まえ、一つのベクターでCas9とguideRNAを同時に発現可能なネムリユスリカ用All-in-One CRISPRベクターの構築も行った。

現在までの達成度

3: やや遅れている

理由

Pv11細胞で十分な発現が認められなかったTALENシステムの代わりとして、実効性のあるCRISPR/Casシステムを構築できたことはよかった。しかしながら、25年度計画の一つであった、Pv11細胞のトランスクリプトームデータベースの構築が遅れている点は、直ちに対応すべき点で有ることと自覚している。26年度中にはデータベース構築を遅延なく行うよう努力する。

今後の研究の推進方策

・ネムリユスリカ培養細胞の乾燥・再吸水時特異的に発現するトランスクリプトームデータベースの構築
乾燥耐性能獲得時に作動する遺伝子ネットワークを知るために、前培養時から乾燥中及び再吸水までの一連の過程の遺伝子発現の変動の様子をmRNA-seqを用いて調査し、トランスクリプトームデータベースを構築する。
・Pv11細胞へのCRISPR発現ベクターの導入と乾燥耐性試験
構築済みのネムリユスリカゲノムデータベースを用いて、乾燥特異的発現を示す遺伝子上のCRISPRターゲット部位をの塩基配列を網羅的に抽出する。得られた配列情報に基づいて、乾燥特異的遺伝子破壊用のAll-in-One CRISPRベクターを構築する。CRISPR/Casシステムによって遺伝子破壊されたPv11細胞を用いて、乾燥耐性能の変化を調べる。正常なPv11細胞と比較して、著しく生存率や増殖率が低下した変異細胞株が得られた場合、機能破壊した遺伝子が乾燥耐性原因遺伝子と判断される。

研究成果

• [雑誌論文] An abundant LEA protein in the anhydrobiotic midge, PvLEA4, acts as a molecular shield by limiting growth of aggregating protein particles (2013)
  • 著者名/発表者名: Hatanaka R, Hagiwara-Komoda Y, Furuki T, Kanamori Y, Fujita M, Cornette R, Sakurai M, Okuda T, Kikawada T
  • 雑誌名: Insect Biochemistry and Molecular Biology 巻: 43 ページ: 1055-1067
  • DOI: 10.1016/j.ibmb.2013.08.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Diversity of LEA-like proteins and its mRNA expression in the sleeping chironomid (2013)
  • 著者名/発表者名: Gusev O, Hatanaka R, Cornette R, Kikawada T
  • 雑誌名: 低温生物工学会誌 巻: 59 ページ: 47-50
  • 査読あり
• [雑誌論文] ネムリユスリカにおけるアンヒドロビオシス誘導機構の分子基盤の解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 黄川田隆洋
  • 雑誌名: 低温生物工学会誌 巻: 59 ページ: 9-13
  • 査読あり
• [学会発表] Oxidative stress and anhydrobiosis in the desiccation-tolerant midge, Polypedilum vanderplanki (2014)
  • 著者名/発表者名: Cornette R, Iwata K, Gusev O, Hatanaka R, Okada J, Kikawada T, Okuda T
  • 学会等名: New Frontiers in Anhydrobiosis
  • 発表場所: ポミシェ、フランス
  • 年月日: 20140323-20140327
• [学会発表] Morphological changes associated with induced complete desiccation resistance in the cell line derived from an anhydrobiotic insect (2014)
  • 著者名/発表者名: Evtugyn V, Okada J, Shagimardanova E, Okuda T, Kikawada T, Gusev O
  • 学会等名: New Frontiers in Anhydrobiosis
  • 発表場所: ポミシェ、フランス
  • 年月日: 20140323-20140327
• [学会発表] Comparative genome sequencing reveals genomic signature of desiccation tolerance in the anhydrobiotic midge (2014)
  • 著者名/発表者名: Gusev O, Suetsugu Y, Cornette R, Kawashima T, Logacheva M, Kondrashov A, Penin A, Hatanaka R, Kikuta S, Shimura S, Katayose Y, Matsumoto T, Shagimardanova E, Alexeev D, Govorun V, Wisecaver J, Mikheyev A, Koyanagi R, Nishiyama T, Shigenobu S, Shibata T.F, Galygina V, Hasebe M, Okuda T, Satoh N, Kikawada T
  • 学会等名: New Frontiers in Anhydrobiosis
  • 発表場所: ポミシェ、フランス
  • 年月日: 20140323-20140327
  • 招待講演
• [学会発表] Comprehensive characterization of LEA proteins in the anhydrobiotic midge Polypedilum vanderplanki (2014)
  • 著者名/発表者名: Hatanaka R, Gusev O, Suetsugu Y, Cornette R, Okada J, Okuda T, Kikawada T
  • 学会等名: New Frontiers in Anhydrobiosis
  • 発表場所: ポミシェ、フランス
  • 年月日: 20140323-20140327
• [学会発表] Construction of optimized CRISPR/Cas system to research the anhydrobiosis in the sleeping chironomid (2014)
  • 著者名/発表者名: Okada J, Kikuta S, Gusev O, Suetugu Y, Cornette R, Yamamoto T, Kikawada T
  • 学会等名: New Frontiers in Anhydrobiosis
  • 発表場所: ポミシェ、フランス
  • 年月日: 20140323-20140327
• [学会発表] Anhydrobiosis vs. aging: comparative genomics of protein repair L-isoaspartyl methyltransferases in the sleeping chironomid (2013)
  • 著者名/発表者名: Gusev O, Suetsugu Y, Shagimardanova E, Kikawada T
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131202-20131206
• [学会発表] ネムリユスリカLEAタンパク質は分子シールドとして乾燥によるタンパク質の凝集形成を抑制する (2013)
  • 著者名/発表者名: 畑中理恵, 黄川田隆洋
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131202-20131206
• [学会発表] カラカラに干からびても死なない生物のゲノム (2013)
  • 著者名/発表者名: 黄川田隆洋, Gusev O, 末次克行, Cornette R, 畑中理恵, 菊田真吾, 志村幸子, 奥田隆
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131202-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] ネムリユスリカの乾燥耐性遺伝子検索のためのゲノム編集技術の構築 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡田淳, 菊田真吾, Gusev O, 末次克行, Cornette R, 山本卓, 黄川田隆洋
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131202-20131206
• [学会発表] ユスリカ科における小さいゲノムサイズと極限環境に対する適応能力 (2013)
  • 著者名/発表者名: コルネット・リシャー, グセフ・オレグ, 志村幸子, 黄川田隆洋, 奥田隆 (2013) ユスリカ科における小さいゲノムサイズと極限環境に対する適応能力
  • 学会等名: 極限環境生物学会第14回年会
  • 発表場所: 明治大学（生田キャンパス）
  • 年月日: 20131026-20131027
• [学会発表] ネムリユスリカLEAタンパク質のin silico解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 畑中理恵, Gusev O, 末次克行, Cornette R, 黄川田隆洋
  • 学会等名: 極限環境生物学会第14回年会
  • 発表場所: 明治大学（生田キャンパス）
  • 年月日: 20131026-20131027
• [学会発表] Understanding the evolution of anhydrobiosis in the sleeping Chironomid, Polypedilum vanderplanki, by comparative genomics (2013)
  • 著者名/発表者名: Cornette R, Gusev O, Suetsugu Y, Okuda T, Kawashima T, Sato N, Nishiyama T, Hasebe M, Kikawada T
  • 学会等名: 5th International Symposium of Environmental Physiology of Ectotherms and Plants
  • 発表場所: ロンドン、カナダ
  • 年月日: 20130812-20130816
• [学会発表] Some like it dry: hsp in the sleeping chrionomid and their role in the complete desiccation resistance (2013)
  • 著者名/発表者名: Gusev O, Shagimardanova E, Rudakova N, Cornette R, Suetsugu Y, Kikawada T
  • 学会等名: FEBS Congress 2013
  • 発表場所: サンクトペテルブルク、ロシア
  • 年月日: 20130706-20130711
  • 招待講演
• [学会発表] 動的光散乱法によるネムリユスリカLEAタンパク質の抗凝集活性測定 (2013)
  • 著者名/発表者名: 黄川田隆洋, 畑中理恵
  • 学会等名: 第58回低温生物工学会セミナー・年会
  • 発表場所: 関西大学
  • 年月日: 20130622-20130623
• [学会発表] 培養細胞の常温乾燥保存は可能になるのか？ ­―極限乾燥耐性昆虫ネムリユスリカのトレハローストランスポーターの応用­― (2013)
  • 著者名/発表者名: 黄川田隆洋
  • 学会等名: 第8回 トランスポーター研究会年会
  • 発表場所: 熊本大学
  • 年月日: 20130615-20130616
  • 招待講演