抗ウイルス状態の誘導を増強する新たな転写後制御メカニズム

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25253030
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 高岡 晃教 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30323611)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 自然免疫 / ウイルス感染 / 抗ウイルス効果 / RNAサイレンシング

研究実績の概要

我々はこれまで行ってきた自然免疫研究の成果を生かし，感染防御機構の分子メカニズムを明らかにすることで，ウイルス感染のコントロールにつながる新しい切り口を見出したいと考えて研究を行っている. これまで我々は，ポリADP-riboseポリメラーゼ スーパーファミリーに属するPARP-13のshort isoformであるZAPS（ZAP, short form）が，ウイルス認識に関与する重要な細胞質RNAセンサーであるRIG-Iと会合することを見出し，ZAPSはRIG-I及び下流のシグナル経路の活性化を強力に誘導する正の制御因子であることを明らかにした．
ZAPSによる自然免疫防御機構をさらに解析する過程で，ZAPSはRIG-Iシグナルでの役割以外に，RNAサイレンシングの制御因子として機能する可能性が示唆された．そこで，我々はウイルス感染防御の今までに無いメカニズムとして，ZAPSを基軸としたRNAサイレンシングの脱制御による“antiviral transcriptome”の活性化という新たな概念を提示したいと考えている．さらに，ウイルス感染以外の刺激やストレスに対する細胞応答時に作動するRNAサイレンシング制御因子をZAPS以外にも探索し，様々な“sub-transcriptome”の存在を追求したい．これまで細胞応答のタンパク質発現誘導の根幹としての従来の転写因子による制御とは全く異なる，特定のサブセットのタンパク質の発現増強に関わる新しい転写後制御機構として，その普遍的な役割の可能性を証明したい．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ZAPS特異的なsiRNAを用いてノックダウンしたHEK293T細胞にIFN処理をし,IFNシグナル下流で発現するInterferon-stimulated genes (ISGs)にZAPSがどのように関与するかについて定量的RT-PCR法により調べた. その結果、IFN下流でZAPSがISGsのmRNAの発現に関与する事が示された．またZAPSによるRIG-Iを介したIFN誘導の影響を排除するために，CRISPR-Cas9システムを用いて，MAVSノックスアウト細胞を樹立した．MAVSノックアウト細胞においても，ZAPSのsiRNAによってISGsの発現誘導が低下することが確かめられた．さらに，昨年度はZAPSとRNA との会合に必要な領域のdeletion mutants を作製した．このdeletion mutantを使用して，ZAPSに結合するmRNAについて，RNA immunorecipitation (RIP) assayを用いて調べた．その結果，複数のISGsがZAPSに結合する事が示された．一方で，ZAPSと類似した構造を有する他のPARPスーパーファミリーに属する分子についても同様の実験系で調べた．

今後の研究の推進方策

昨年度の結果を踏まえ，本年度は，HITS-CLIPを用いてZAPSに会合する内因性の標的mRNAサブセットを網羅的に同定することや,IFN下流で作用するZAPSの機能メカニズムについて研究を行う予定である.
(1)ZAPSと会合する宿主由来の mRNA サブセットの網羅的な同定:HITS-CLIP (high-throughput RNA sequencing of cross-linked immunoprecipitation) の アプローチを用いて,候補分子に結合/制御されていると考えられる mRNAs を網羅的に解析する.
(2)同定された mRNAs とZAPSとの会合特性についての解析:同定された mRNAs と候補分子との会合について,まず,各 mRNA 側のどの領域を介して候補分子と会合するかを明らかにする.これらの結果を基に RNA の配列特異性の有無について検討し,それがみとめられない場合にはターゲットとなる mRNA 側の構造などの解析結果を基に会合特性を決める.昨年度,ZAPSのRNA との会合に必要な領域のdeletion mutants を作製した.これを用いて上記の解析を行う予定である.

研究成果

• [雑誌論文] The RNA Sensor RIG-I Dually Functions as an Innate Sensor and Direct Antiviral Factor for Hepatitis B Virus (2014)
  • 著者名/発表者名: Seiichi Sato, Kai Li, Takeshi Kameyama, Takaya Hayashi, Yuji Ishida, Shuko Murakami, Tsunamasa Watanabe, Sayuki Iijima, Yu Sakurai, Koichi Watashi, Susumu Tsutsumi, Yusuke Sato, Hidetaka Akita, Takaji Wakita, Charles M. Rice, Hideyoshi Harashima, Michinori Kohara, Yasuhito Tanaka, Akinori Takaoka
  • 雑誌名: Immunity 巻: 42 ページ: 123-132
  • DOI: 10.1016/j.immuni.2014.12.016
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Direct and indirect roles of RIG-I for antiviral defense against hepatitis B virus in human hepatocytes (2014)
  • 著者名/発表者名: Akinori Takaoka
  • 学会等名: International Conference on Antimicrobial Research
  • 発表場所: Madrid (Spain)
  • 年月日: 2014-10-01 – 2014-10-03
• [学会発表] Role of the cytoplasmic RNA sensor RIG-I in innate immune defense against hepatitis B virus infection (2014)
  • 著者名/発表者名: Akinori Takaoka
  • 学会等名: 11th International Conference on Innate Immunity
  • 発表場所: Olympia (Greece)
  • 年月日: 2014-06-01 – 2014-06-06
• [図書] Characterization of innate immune signalings stimulated by nucleic acid sensors. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kameyama, T. Takaoka, A
  • 総ページ数: 19-32
  • 出版者: Method in Mol. Biology.
• [備考] ライフサイエンス 新着論文レビュー
  • URL: http://first.lifesciencedb.jp/archives/9761