抗ウイルス状態の誘導を増強する新たな転写後制御メカニズム

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25253030
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 高岡 晃教 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30323611)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 自然免疫 / ウイルス感染 / 抗ウイルス効果 / RNAサイレンシング

研究実績の概要

我々はこれまで行ってきた自然免疫研究の成果を生かし，感染防御機構の分子メカニズムを明らかにすることで，ウイルス感染のコントロールにつながる新しい切り口を見出したいと考えて研究を行っている. これまで我々は，ポリADP-riboseポリメラーゼ スーパーファミリーに属するPARP-13のshort isoformであるZAPS（ZAP, short form）が，ウイルス認識に関与する重要な細胞質RNAセンサーであるRIG-Iと会合することを見出し，ZAPSはRIG-I及び下流のシグナル経路の活性化を強力に誘導する正の制御因子であることを明らかにした．
ZAPSによる自然免疫防御機構をさらに解析する過程で，ZAPSはRIG-Iシグナルでの役割以外に，RNAサイレンシングの制御因子として機能する可能性が示唆された．そこで，我々はウイルス感染防御の今までに無いメカニズムとして，ZAPSを基軸としたRNAサイレンシングの脱制御による“antiviral transcriptome”の活性化という新たな概念を提示したいと考えている．さらに，ウイルス感染以外の刺激やストレスに対する細胞応答時に作動するRNAサイレンシング制御因子をZAPS以外にも探索し，様々な“sub-transcriptome”の存在を追求したい．これまで細胞応答のタンパク質発現誘導の根幹としての従来の転写因子による制御とは全く異なる，特定のサブセットのタンパク質の発現増強に関わる新しい転写後制御機構として，その普遍的な役割の可能性を証明したい．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ZAPSに結合するmRNAをRNA immunorecipitation assayを用いて検討し，Zinc finger領域がRNA結合性に関与することを明らかにした．一方で，ZAPSはRIG-I-MAVSシグナル伝達経路を介して，定常状態においても非常に微量なIFN産生に関与することが分かり，この構成的なIFNによるIFNシグナルがInterferon-stimulated genes (ISGs)の発現に影響する可能性が考えられた．そこでこの構成的なIFNによるISGs産生と，ZAPSによるRIG-I-MAVS経路活性化の影響を排除するためCrispr-Cas9システムを用いて，ヒトのMAVS欠損細胞を樹立した．MAVS欠損細胞にZAPS特異的なsiRNAを用いてZAPSを抑制し，IFNシグナル下流で発現する ISGsにZAPSがどのように関与するかについて定量的RT-PCR法により調べた．ZAPSをノックダウンするとIFN-β処理８時間後に誘導されるVIPERN, MX1, OAS2, ISG15などのISGs mRNAは減少することが分かった．Western blot解析によりVIPERINおよびMX1のタンパクも減少することを明らかにした．一方で，各種ISGsのプロモーター領域をクローニングし，Luciferase assayを行ったところ，ZAPSのノックダウンによってプロモーター活性は低下しなかったことから，ZAPSは転写以降のステップに作用している事が考えられた．今後，特異的なISGsがZAPSによってどのようにmRNAの発現を制御するのかについて解明していきたい．また， ZAPS以外のポリADPリボースポリメラーゼスーパーファミリーメンバーや，ZAPSに結合する蛋白が，自然免疫シグナルにおいてどのような役割を担っているかについて検討をすすめている．

今後の研究の推進方策

来年度はインターフェロン(IFN)下流で誘導されるInterferon-stimulated genes(ISGs) の発現制御にZAPSの詳細な作用機序について明らかにしたい．そこで下記のような実験を計画した．
(1) ZAPSがmRNAの安定性にあたる影響について．ZAPSがISGs mRNAの安定性に関与するかについて，アクチノマイシンDを用いた定量的RT-PCR法により検討する．またBRIC assayを使用してmRNAの安定性について検証したい．一方でISGs mRNAのクローニングを行いた過剰発現系や，レポーターベクターを用いたluciferase assayによりmRNAの配列との関連性について検討したい．(2) ZAPSがmRNAの核外輸送に与える影響について．ZAPSがmRNAの核外輸送に影響するかについて，細胞を核と細胞質に分画し，それぞれの画分から抽出されるRNAを　定量的RT-PCR法により測定することでZAPSがmRNAの核外輸送に関与しているのかについて調べる．(3) ZAPSがmRNAのスプライシングに与える影響について．ZAPSがmRNAのスプライシングに関与するのかについて，スプライソソームとの会合や局在性を検証したい．また複数のイントロンを持つISGs mRNAと持たないISGs mRNAに対する影響性について定量的RT-PCR法により検証する予定である．
これらの課題を，ZAPS特異的なsiRNAを用いた実験や， RNA との会合に必要な領域のdeletion mutants を作製しているので，この発現ベクターを用いた実験系で解析をする予定である．また ZAPS以外のPARPファミリーメンバーが，これらの制御にどのように関与しているかについても検討をすすめたい．

研究成果

• [雑誌論文] Helicobacter pylori induces IL-1β protein through the inflammasome activation in differentiated macrophagic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kameoka S, Kameyama T, Hayashi T, Sato S, Ohnishi N, Hayashi T, Murata-Kamiya N, Higashi H, Hatakeyama M, Takaoka A.
  • 雑誌名: Biomedical Research 巻: 37 ページ: 21-27
  • DOI: 10.2220/biomedres.37.21
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Superoxide Dismutase 1 Protects Hepatocytes from Type I Interferon-Driven Oxidative Damage. (2015)
  • 著者名/発表者名: Bhattacharya A, Hegazy AN, Deigendesch N, Kosack L, Cupovic J, Kandasamy RK, Hildebrandt A, Merkler D, Kühl AA, Vilagos B, Schliehe C, Panse I, Khamina K, Baazim H, Arnold I, Flatz L, Xu HC, Lang PA, Aderem A, Takaoka A, Superti-Furga G, Colinge J, Ludewig B, Löhning M, Bergthaler A.
  • 雑誌名: Immunity 巻: 43 ページ: 974-986
  • DOI: 10.1016/j.immuni.2015.10.013
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The microRNA miR-485 targets host and influenza virus transcripts to regulate antiviral immunity and restrict viral replication. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ingle H, Kumar S, Raut AA, Mishra A, Kulkarni DD, Kameyama T, Takaoka A, Akira S, Kumar H.
  • 雑誌名: Science Signaling 巻: 8 ページ: ra126
  • DOI: 10.1126/scisignal.aab3183.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Innate sensor-mediated IFN antiviral response and its regulatory mechanism (2016)
  • 著者名/発表者名: 髙岡晃教
  • 学会等名: Einladung zum gemeinsamen COLLOQUIUM (Invited Speaker Seminar)
  • 発表場所: Vienna, Austria
  • 年月日: 2016-02-25 – 2016-02-25
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Tumor suppressive effect driven by cytoplasmic RNA-mediated innate signaling (2015)
  • 著者名/発表者名: 髙岡晃教
  • 学会等名: 8th Euro Global Summit on Cancer Therapy
  • 発表場所: Valencia,Spain
  • 年月日: 2015-11-03 – 2015-11-05
  • 国際学会
• [学会発表] Dual fection of RIG-I RNA helicase as an innate sensor and as a direct antiviral effector during hepatitis B virus infection (2015)
  • 著者名/発表者名: 髙岡晃教
  • 学会等名: 15th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases
  • 発表場所: Berlin, Germany.
  • 年月日: 2015-06-26 – 2015-06-28
  • 国際学会
• [学会発表] CYTOPLASMIC RNA SENSOR RIG-I DUALLY MEDIATES ANTIVIRAL ACTIVITIES DURING HBV INFECTION (2015)
  • 著者名/発表者名: 髙岡晃教
  • 学会等名: 2nd World Conference on Targeting Liver Diseases
  • 発表場所: St Julian's, Malta
  • 年月日: 2015-06-25 – 2015-06-26
  • 国際学会
• [学会発表] NLRP3 recognizes Hericobacter pylori CagA protein to induce IL-1beta response (2015)
  • 著者名/発表者名: 髙岡晃教
  • 学会等名: 12th International Conference on Innate Immunity
  • 発表場所: Chania, Crete, Greece
  • 年月日: 2015-06-19 – 2015-06-24
  • 国際学会