ALSの発症に関わるADAR2遺伝子発現異常を引き起こす分子病態の解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25253063
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 郭 伸 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (40160981)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: RNA編集 / 筋萎縮性側索硬化症 / アデノシンデアミナーゼ / 遺伝子 / 転写因子

研究概要

孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者の運動ニューロンでは、グルタミン酸受容体であるAMPA受容体サブユニットGluA2のRNA編集効率が低下している。この分子変化は未編集型GluA2をサブユニットにもつAMPA受容体からのCa2+流入増大を通じて運動ニューロン死を引き起こすことが分子病態モデルマウスの解析から明らかになった。この分子異常は専らRNA編集酵素 adenosine deaminase acting on RNA 2 (ADAR2)の 発現が進行性に低下することに依るため、ヒトADAR2遺伝子ADARB1の発現制御機構を明らかにする必要がある。そのためADARB1遺伝子発現に関わる転写因子・制御因子の同定を目的とする。
ADARB1遺伝子open reading frame (ORF)の上流3kbp内にプロモーター領域が存在すると考え、この想定プロモーター領域3kbpの下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋いだコンストラクトを作成し、このコンストラクトをstableに発現するルシフェラーゼレポーターアッセイ系をHeLa細胞を用いて構築した。
上記の想定プロモーター領域をデータベース上で検索し、ヒストン修飾、DNaseI感受性などから、ヒトADAR2遺伝子プロモーター領域を絞り込み、そこに結合する転写因子候補を特定した。
上記の候補転写因子群および既報のALS運動ニューロンで変化していると報告されている転写因子につき、作成したレポーターアッセイ系およびsiRNAを用いたノックダウンによりADARB1遺伝子の発現に影響を及ぼす転写因子候補を検索した。
これらの実験から、候補転写因子1種（TF-X）を特定することができた。複数の転写因子が共同してADARB1遺伝子の発現制御に関わっている可能性が高いので、TF-Xと共同して働く候補転写因子群の検索を更に進める。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ADARB1遺伝子制御メカニズムを解析するためのレポーターアッセイ系を培養細胞系を用いて構築した。このレポーターアッセイ系および培養細胞を用いた遺伝子発現への調節作用の検討から、ADARB1遺伝子発現制御に関わる転写因子候補の絞り込みが進んでいる。

今後の研究の推進方策

最近データが新たに加わってきたウェブ上の遺伝子情報を活用して、遺伝子発現に関わる転写因子、プロモーター、エンハンサー部位の特定を更に進める。複数の転写因子の関与が想定されるため、既に特定したTF-Xに加え、複数の転写因子による遺伝子制御機構を培養細胞系で確認する。更に、ADARB1遺伝子への結合部位を特定し転写因子の作用部位を明らかにしていく。

研究成果

• [雑誌論文] Unique nuclear vacuoles in motor neurons of conditional ADAR2-knockout mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, S., Yamashita, T., Hideyama T, Kwak, S.
  • 雑誌名: Brain Res. 巻: 1550 ページ: 36-46
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2014.01.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, T., and Kwak, S.
  • 雑誌名: Brain Res. 巻: in press. ページ: .
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2013.12.011.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic and epigenetic studies of amhyotrophic lateral sclerosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Al-Chalabi, A., Kwak, S., Mehler, M., Rouleau, G., Siddique, T., Strong, M., Leigh, PN.
  • 雑誌名: Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 巻: 14 ページ: 44-52
  • DOI: 10.3109/21678421.2013.778571.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rescue of amyotrophic lateral sclerosis phenotype in a mouse model by intravenous AAV9-ADAR2 delivery to motor neurons. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, T., Chai, H., Teramoto, S., Tsuji, S., Shimazaki, K., Muramatsu, S., Kwak, S.
  • 雑誌名: EMBO Mol Med 巻: 5 ページ: 1710-1719
  • DOI: 10.1002/emmm.201302935.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Akamatsu, M., Takuma, H., Yamashita, T., Okada, T., Keino-Masu, K., Kazuhiro, Ishii K., Kwak, S., Masu, M., Tamaoka, S.
  • 雑誌名: Neurosci Res. 巻: 77 ページ: 234-241
  • DOI: 10.1016/j.neures.2013.09.009.
  • 査読あり
• [学会発表] A step for mechanism-based ALS therapy. International symposium “New Frontier of Molecular Neuropathology 2014” (2014)
  • 著者名/発表者名: Kwak, S.
  • 学会等名: CREST-新学術共催国際シンポジウム
  • 発表場所: 東京、日本
  • 年月日: 20140316-20140317
  • 招待講演
• [学会発表] Calpain-dependent cleavage of TDP-43 plays a crucial role in ALS pathology. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Takano, J., Iwata, N., Saido, TC., Kwak, S.
  • 学会等名: The 44th Annual Meeting Society for Neuroscience
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 20131109-20131113
• [学会発表] ADAR2-dependent death and TDP-43 mislocalization in motor neurons. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kwak, S., Yamashita. T., Teramoto, S., Chai, HL.
  • 学会等名: 8th Brain Research conference “RNA binding proteins in neurological disease”
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 20131107-20131108
• [学会発表] Calpain-dependent cleavage of TDP-43 plays a crucial role in ALS pathology. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Takano, J., Iwata, N., Saido, TC., Kwak, S.
  • 学会等名: 8th Brain Research conference “RNA binding proteins in neurological disease”
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 20131107-20131108
• [学会発表] Calpain cleavage of TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis. Biology of Clpains in Health and Disease. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kwak, S.
  • 学会等名: Science Research Conferences FASEB
  • 発表場所: Saxtons River, Vermont,USA
  • 年月日: 20130721-20130726
  • 招待講演
• [学会発表] ClapainがALSのTDP-43病理形成に果たす役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山下雄也、日出山拓人、寺本さやか、高野二郎、岩田修永、西道隆臣、郭 伸
  • 学会等名: 第35回神経組織培養研究会
  • 発表場所: 大阪、日本
  • 年月日: 20130629-20130630
• [学会発表] ClapainがALSのTDP-43病理形成に重要な役割を果たす (2013)
  • 著者名/発表者名: 山下雄也、日出山拓人、寺本さやか、高野二郎、岩田修永、西道隆臣、郭 伸
  • 学会等名: 第36回日本神経科学大会Neuro2013
  • 発表場所: 京都、日本
  • 年月日: 20130620-20130623
• [学会発表] AMPA receptor-mediated activation of calpain triggers TDP-43 pathology in ALS by cleaving TDP-43 into aggregation-prone fragments. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kwak, S.
  • 学会等名: GRC Calcium signaling
  • 発表場所: Lucca, Italy
  • 年月日: 20130616-20130621
• [学会発表] Molecular mechanism generating TDP-43 pathology in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) motor neurones. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kwak, S., Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S.
  • 学会等名: The 23rd Meeting of the European Neurological Society.
  • 発表場所: Balcerona, Spain
  • 年月日: 20130608-20130611
• [学会発表] AMPA受容体サブユニットGluA2のQ/R 部位RNA編集率に対する薬剤の効果 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤田準、相澤仁志、淺野目明日香、高橋佳恵、斉藤司、片山隆行、長谷部直幸、山下雄也、郭 伸
  • 学会等名: 第54回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 東京、日本
  • 年月日: 20130530-20130601
• [学会発表] マウス胎仔電気穿孔法によるin vivo TDP-43遺伝子導入と封入体形成の検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 詫間浩、赤松恵、山下雄也、岡田拓也、石井一弘、桝和子、郭 伸、桝正幸、玉岡晃
  • 学会等名: 第54回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 東京、日本
  • 年月日: 20130530-20130601
• [図書] 医学の歩み 247 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山下雄也、郭 伸
  • 総ページ数: 9
  • 出版者: 医歯薬出版
• [図書] シリーズ＜アクチュアル脳・神経疾患の臨床＞ (2013)
  • 著者名/発表者名: 郭 伸
  • 総ページ数: 10
  • 出版者: 中山書店
• [備考] 東京大学大学院医学系研究科 疾患生命工学センター 臨床医工学部門 郭研究室
  • URL: http://square.umin.ac.jp/teamkwak