小児外科領域の難治性疾患における脱落乳歯幹細胞を用いた新規治療法の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25253094
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 田口 智章 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20197247)
• 研究分担者: 野中 和明 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (90128067) ; 大賀 正一 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60233053) ; 中山 功一 佐賀大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50420609) ; 小田 義直 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70291515) ; 井原 健二 大分大学, 医学部, 教授 (80294932) ; 山座 孝義 九州大学, 歯学研究科(研究院), 講師 (80304814) ; 山座 治義 九州大学, 歯学研究科(研究院), 講師 (30336151) ; 柳 佑典 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (30596664) ; 家入 里志 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00363359) ; 林田 真 九州大学, 大学病院, 助教 (70452761) ; 永田 公二 九州大学, 大学病院, 助教 (20419568) ; 吉丸 耕一朗 九州大学, 大学病院, その他 (60711190)
• 研究期間 (年度): 2013-10-21 – 2016-03-31
• キーワード: 再生医学 / 幹細胞移植 / 乳歯幹細胞 / 代謝性肝疾患 / 先天性横隔膜ヘルニア / 肺低形成 / 肝組織工学

研究実績の概要

肝臓
１）乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の安全性試験①乳歯幹細胞または乳歯幹細胞由来肝細胞を免疫不全マウスの皮下ならびに精巣へ移植し、移植後８週まで移植部位を観察した所、非移植部位と比較して異常増殖は認められなかった。また、飼育期間中のマウスの体重減少等の全身的異常も認められなかった。②四塩化炭素誘導性肝障害モデルに、乳歯幹細胞ならびに乳歯幹細胞由来肝細胞を経脾的に移植後４週にて採取した肝組織より病理組織学的標本を作製した。H&E染色による、レシピエント肝組織に腫瘍増殖を思わせる所見は認められなかった。また抗HLA-ABC抗体ならびに抗HepPar1抗体を用いた免疫組織学的解析により、ドナー細胞の生着が認められた。しかし、ドナー細胞による腫瘍組織像は観察されなかった。③乳歯幹細胞と乳歯幹細胞由来肝細胞を比較したCGH解析では、明らかなゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常は検出されなかった。
2)乳歯幹細胞由来肝細胞を用いた機能的肝立体構造体の製造系の条件確立:ヒト乳歯幹細胞由来肝細胞より段階的に細胞数を変えてスフェロイドを作成。スフェロイド形成期間、サイズ、低酸素マーカー染色、TUNNEL染色による細胞生存率を解析し、最適なスフェロイド作成条件を決定した。
3) 立体構造体の移植適正部位の検討: 異所性移植では胆汁排泄ができないため肝臓内移植とし、①肝臓内に埋植②肝切離断端に移植の２方法を比較検討した。まず、ラット肝臓より切り出した組織片での移植では、前者で組織の圧迫所見がみられ後者のほうが生着がよかった。
横隔膜
ヒト横紋筋芽細胞、臍帯静脈内皮細胞、骨髄由来幹細胞を用いて血管内皮ネットワークを有する1x1cmの横紋筋シートを作製することに成功した。また、ニトロフェン誘導先天性横隔膜モデル胎仔ラットに対する成獣肺間葉系幹細胞投与の肺成熟効果に関し、論文投稿した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通り乳歯幹細胞の肝細胞への分化誘導法を確立および、免疫寛容性が高いことをin vitroで確認した。さらには、小動物に対して非免疫抑制下に異種移植実験を行い拒絶されないことを確認し、疾患モデル動物に対するSHED由来肝細胞の生着および生命予後および肝機能の改善を確認した。また、本年度は造腫瘍性がないことなど安全性の確認を行い、これらの結果からSHED由来肝細胞の安全性、有効性が確認され、臨床応用において有用な細胞ソースであることが実証された。立体組織化も昨年度のラットに引き続きヒト成熟肝細胞を用いて成功し、本年度はSHED由来肝細胞をを用いた立体肝組織の作製条件を検討し、立体組織作製が可能となった。横隔膜ヘルニアに対する研究においては、幹細胞移植が肺低形成に対する治療効果が有することを確認したが、今後はSHEDでの有効性の評価が必要と考える。また、培養ヒト骨格筋芽細胞を用いて細胞シートの作成に成功したが、移植に耐えうる強度には達しておらず今後も検討が必要である。

今後の研究の推進方策

肝臓においては、SHED由来肝細胞の細胞移植による有効性が確認できたため、今後はSHED由来肝細胞を用いた立体肝組織移植の有効性実証を進めていく予定である。
具体的には、1）ヒト乳歯幹細胞由来肝細胞を用いた立体肝組織の最適化：ヒト歯髄幹細胞由来肝細胞よりバイオ3Dプリンターを用いて、立体肝組織を作製する。立体肝組織の細胞の生存率及びアンモニア代謝やアルブミン産生などを指標に最適化を行う。2）立体肝組織移植の有効性評価：　ヒト乳歯幹細胞を用いた立体肝組織を四塩化炭素誘導性肝障害モデルマウスやOTC欠損マウスに対し肝臓内に移植し、治療効果を検証する。
横隔膜においては、引き続き移植可能な横紋筋シートの作製を進めていく。肺低形成に対する治療では組織幹細胞の有効性が確認されたため、今後はSHEDの有効性の検証を進めていく。
具体的には、1) ヒト培養横紋筋芽細胞を用いた横紋筋シートの作製：ヒト培養横紋筋芽細胞から細胞凝集体（スフェロイド）を作製し、ロボットシステムを用いて横紋筋シートを作製する。作製したシートの強度解析を行う。特に、HUVECやMSCとの共培養や、還流培養、伸展培養などを用いて強度の向上を図る。2)外科的CDHモデルラットにおける横隔膜シートを用いた横隔膜修復試験：ヌードラットにおいて左横隔膜に横隔膜欠損孔を作製する。ヒト培養横紋筋細胞横隔膜シートを用いて欠損孔を修復する。ラットの生存率およびシートの形態的、病理学的評価を行う。3) ニトロフェン誘導CDHモデルラットの低形成肺に対するSHED投与の有効性、安全性確認：肺低形成を伴うCDHモデルラットにSHEDを経静脈投与。肺成熟効果の解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Hirschsprung病類縁疾患の分類 (2015)
  • 著者名/発表者名: 田口智章、渡邉芳夫、松藤 凡、藤澤正洋
  • 雑誌名: 小児外科 巻: 47(4) ページ: 372-376
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nationwide survey of the outcomes of living donor liver transplantation for hepatoblastoma in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto S, Kasahara M, Mizuta K, Kuroda T, Yagi T, Taguchi T, Inomata Y, Umeshita K, Uemoto S
  • 雑誌名: Liver Transpl 巻: 20(3) ページ: 333-346
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolated intestinal neuronal dysplasia Type B (IND-B) in Japan: results from a nationwide survey. (2014)
  • 著者名/発表者名: Taguchi T, Kobayashi H, Kanamori Y, Segawa O, Yamataka A, Sugiyama M, Iwanaka T, Shimojima N, Kuroda T, Nakazawa A, Oda Y, Miyoshi K,Ieiri S.
  • 雑誌名: Pediatr Surg Int 巻: 30(8) ページ: 815-822
  • DOI: 10.1007/s00383-014-3542-6.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Therapeutic potential of mesenchymal stem cell transplantation in a nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia rat model. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuniartha R, Alatas FS, Nagata K, Kuda M, Yanagi Y, Esumi G, Yamaza T, Kinoshita Y, Taguchi T.
  • 雑誌名: Pediatr Surg Int 巻: 30(9) ページ: 907-914
  • DOI: 10.1007/s00383-014-3576-9.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pediatric chronic intestinal pseudo-obstruction is a rare, serious, and intractable disease: A report of a nationwide survey in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Muto M, Matsufuji H, Tomomasa T, Nakajima A, Kawahara H, Ida S, Ushijima K, Kubota A, Mushiake S, Taguchi T.
  • 雑誌名: J Pediatr Surg 巻: 49(12) ページ: 1799-1803
  • DOI: 10.1016/j.jpedsurg.2014.09.025.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Hirschsprung病類縁疾患の小腸移植の適応 (2015)
  • 著者名/発表者名: 田口智章、渡邉芳夫、金森 豊、松藤 凡、曹 英樹、福澤正洋、家入里志、松浦俊治、林田 真、吉丸耕一朗、栁 佑典
  • 学会等名: 第27回日本小腸移植研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2015-03-14
  • 招待講演
• [学会発表] 小児血液・がんと肝移植および肝再生医療 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田口智章、木下義晶、宗崎良太、川久保尚徳、松浦俊治、林田 真、柳 佑典
  • 学会等名: 第56回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2014-11-28 – 2014-11-30
• [学会発表] Clinical Courses of “Suspected” Intestinal Neuronal Dysplasia (2014)
  • 著者名/発表者名: Obata S, Ieiri S, Jinbo T, Yoshimaru K, Miyoshi K, Miyata J, Taguchi T
  • 学会等名: XVIIth INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON PAEDIATRIC SURGICAL RESEARCH
  • 発表場所: Toronto, Canada
  • 年月日: 2014-09-22 – 2014-09-23
• [学会発表] Congenital hypoganglionosisにおける治療方針の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 福原雅弘、永田公二、江角元史郎、宗崎良太、林田 真、松浦俊治、家入里志、木下義晶、田口智章
  • 学会等名: 第44回九州小児外科研究会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2014-09-06
• [学会発表] Congenital hypoganglionosis と超短腸症候群の治療方針に関する検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 永田公二、江角元史郎、宗崎良太、林田 真、松浦俊治、家入里志、木下義晶、田口智章
  • 学会等名: 日本外科代謝栄養学会第51回学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-07-04 – 2014-07-05
• [学会発表] Isolated intestinal neuronal dysplasia Type B in Japan-results from nationwide survey. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ｔaguchi T, Miyoshi K, Ieiri S,Kobayashi H, Yamataka A,Shimojima N, Kuroda T
  • 学会等名: EUPSA2014
  • 発表場所: Dublin, Ireland
  • 年月日: 2014-06-18 – 2014-06-21
• [学会発表] ISOLATED INTESTINAL NEURONAL DYSPLASIA TYPE B IN JAPAN-RESULTS FROM NATIONWIDE SURVEY- (2014)
  • 著者名/発表者名: Taguchi T, Miyoshi K, Ieiri S,Kobayashi H, Yamataka A, Shimojima N, Kuroda T
  • 学会等名: 21st INTERNATIONAL MEETING OF THE PEDIATRIC COLORECTAL CLUB
  • 発表場所: Dublin
  • 年月日: 2014-06-15 – 2014-06-17
• [学会発表] Current status and prognosis of allied disorders of Hirschsprung's disease in Japan-A report from Japanese Study Group of allied disorders of Hirschsprung's disease- (2014)
  • 著者名/発表者名: Taguchi T,Ieiri S,Miyoshi K,Watanabe Y,Kobayashi H,Fukuzuwa M,Hamada Y,Yagi M,Matsufuji H,Nakazawa A,Kubota A,Iwanaka T,Matsui A
  • 学会等名: PAPS2014
  • 発表場所: Banff,Alberta
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-29
• [学会発表] ヒルシュスプルング病類縁疾患(H類縁)の歴史，定義，分類，予後 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田口智章
  • 学会等名: 第51回日本小児外科学会学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-05-08 – 2014-05-10
• [学会発表] 四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスに対するヒト脱落乳歯幹細胞移植療法の有効性に関する研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 栁 佑典、Fatima Safira Alatas、吉丸耕一朗、林田 真、大賀正一、山座治義、山座孝義、田口智章
  • 学会等名: 第51回日本小児外科学会学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-05-08 – 2014-05-10
• [学会発表] Therapeutic potential of mesenchymal stem cell transplantation in nitrofen induced Congenital Diaphragmatic Hernia rat model (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuniarthaa R, Nagataa K , Alatasa FS, Kudaa M, Yanagia Y , Esumia G, Yamazab T, Kinoshitaa Y, Taguchi T
  • 学会等名: 第51回日本小児外科学会学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-05-08 – 2014-05-10
• [図書] 小児栄養消化器肝臓病学 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田口智章、玉井 浩、友政 剛、松井 陽 編集主幹
  • 総ページ数: 560
  • 出版者: 株式会社 診断と治療社
• [図書] スタンダード小児外科手術 押さえておきたい手技のポイント (2014)
  • 著者名/発表者名: 田口智章、木下義晶、永田公二
  • 総ページ数: 387
  • 出版者: メジカルビュー社