研究課題
トポイソメラーゼ阻害剤は、有望な抗がん剤、抗生物質として広く使用されている。この阻害剤は、トポイソメ ラーゼの再結合を阻害することで、チロシンを介したタンパク質クロスリンクおよび一本鎖DNA切断を伴うDNA損傷を導き、この損傷が細胞を死に至らしめると考えられている。本研究は、このタンパク質クロスリンクを有する1本鎖DNA切断を生体内でどのように修復するか？その分子機構を生化学的および細胞生物学的に解析していくことを目的としている。トポイソメラーゼ阻害剤は、それぞれトポイソメラーゼI型の阻害剤カンプトテシン、またトポイソメラーゼII 型の阻害剤エトポシドなどが存在する。さらにそれぞれのトポイソメラーゼがDNAの切断末端の3‘および5’ にチロシンを付加することになる。我々はこの２つのタイプのチロシンが付加したオリゴヌクレオチドを用いて、修復DNA基質を作製した。無細胞系修復反応によりそれぞれの修復機構を解析する予定であったが、基質の純度および副反応が多く存在したため、精製タンパク質による解析に変更し、現在、再構成系により修復機構を解析中である。
2: おおむね順調に進展している
トポイソメラーゼ阻害剤は、それぞれトポイソメラーゼI型の阻害剤カンプトテシン、またトポイソメラーゼII 型の阻害剤エトポシドなどが存在する。さらにそれぞれのトポイソメラーゼがDNAの切断末端の3‘および5’ にチロシンを付加することになる。我々はこの２つのタイプのチロシンが付加したオリゴヌクレオチドを用いて、修復DNA基質を作製した。しかしながら、無細胞系修復反応によりそれぞれの修復機構を解析する予定であったが、基質の純度および副反応が多く存在したため、精製タンパク質による解析に変更した。この変更は当初予測されていたので、研究全体としては概ね順調に進展している。また、結果として精製タンパク質により修復の再構成系を確立できたことは、大きな進展と言える。
トポイソメラーゼ阻害剤は、それぞれトポイソメラーゼI型の阻害剤カンプトテシン、またトポイソメラーゼII 型の阻害剤エトポシドなどが存在する。さらにそれぞれのトポイソメラーゼがDNAの切断末端の3‘および5’ にチロシンを付加することになる。 3’-および5’-チロシン付加一本鎖DNA切断損傷のDNA基質を作製し、これを切断できる酵素を探索した結果、 ヌクレオチド除去修復に関わる構造特異的3’ヌクレアーゼERCC1-XPFが3-チロシン付加一本鎖DNA切断損傷を 切断できることがわかった。また、その反応には複製タンパク質因子RPAが必要であることが示唆された。これに加えて、精製タンパク質を添加することで完全にDNA修復合成が観察することができた。これらの点を踏まえて、細胞学的な解析を加えるために、GFP-XPFを作製し、RPAおよびその他のタンパク質分子との局在を解析する予定である。これらの挙動はカンプトテシンによるDNA損傷の新規の修復機構を示唆すると考える。一方、5’-チロシン付加一本鎖DNA切断損傷のDNA基質において、構造特異的5’ヌクレアーゼFEN1がその修復 に関わることが明らかとなった。修復がどのように完成するかをDNA ポリメラーゼ及びDNA リガーゼを加えることで解析する。また、タンパク質のノックダウンによりその修復活性を細胞学的に解析する予定である。さらに新規のDNAヌクレアーゼがトポイソメラーゼ阻害剤により生じるDNA損傷の修復に関わることが示唆されており、このタンパク質の精製および抗体を作製し、どのように修復に関わるのかを3’-および5’-チロシン付加一本鎖DNA切断損傷基質を用い生化学的にまたこのタンパク質のノックダウン細胞を作製し、細胞学的に解析する。
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