| 研究実績の概要 |
放射線や化学変異原により誘発される遺伝的不安定性は興味深い現象であり、発がん等長い潜伏期を経て発症する生体影響には極めて重要な要因である。何らかの損傷メモリーが関与すると考えられるが、その実体は明らかでない。本申請では、ゲノム編集技術を用いゲノムの特定領域に損傷を導入し、導入損傷により誘発される不安定性の検出をゲノム上に散在する標的配列で行う系を確立する。損傷導入領域・変異検出領域において、損傷メモリーの有力な候補であるゲノムDNAやクロマチンの修飾を解析し、損傷メモリーの実体を明らかにする。これに加え損傷応答遺伝子変異体による解析を行い、損傷メモリー形成・維持に関わる経路の同定を行う。
損傷応答遺伝子p53,ATM,ATR,DNA-PKcsの変異体については既に作製しており、このうち成魚まで生育しない、もしくはし難いATR,DNA-PKcsについてはレスキュー用BACの作製を行った。このとき、レスキュー後さらに任意の組織、細胞でノックアウトできるようにそれぞれの遺伝子領域をloxPではさみ、Creの発現により遺伝子領域が抜けたあとGFPが発現し始めるようにして確認できるよう工夫した。
損傷導入部位でのエピジェネティック変化/クロマチン構造変化を検出するために、まずEGFPを1コピー持つtransgenicメダカ胚(in vivo系)、及び胚由来培養細胞に対しEGFPに対するCRISPRを作用させ、DSBが起きた周辺(EGFPの周辺)と周辺外のマイクロサテライトの変化を見ることにした。我々はこれまでにγ線によりマイクロサテライト不安定性が高頻度に検出される領域を同定しており、この高頻度領域と低頻度領域とでDSBによるエピジェネティックな変化を比較することによりマイクロサテライト不安定性との相関を明らかにしたいと考えた。EGFPに効率よく作用するCRISPRが作成できた。
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