| 研究課題/領域番号 |
25281024
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
鯉淵 典之 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80234681)
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| 研究分担者 |
下川 哲昭 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90235680)
岩崎 俊晴 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80375576)
竹下 章 公益財団法人冲中記念成人病研究所, その他部局等, 研究員 (20322646)
高鶴 裕介 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30446265)
はい島 旭 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70555672)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 甲状腺ホルモン / 内分泌かく乱化学物質 / 脳発達 |
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| 研究概要 |
胎生初期に構築された神経回路は発達期に再編成され機能的に成熟する。この際，神経・液性因子を介する環境からの刺激が不可欠である。液性因子ではステロイドや甲状腺ホルモンなど核内受容体(NR)と結合するホルモンが重要である。しかし，NR を介する転写レベルのかく乱作用によりニューロンにどのような機能的変化が生じ，高次脳機能異常につながるのか明らかではない。そこで，in vitro の分子生物学的実験を，モデル動物を用いた2 光子励起顕微鏡によるシナプス動態の長期的観察，電気生理学的解析，および行動解析実験と組み合わせ，統合的に解析した。具体的実績は以下の通り。
１）ホルモン環境を変化させたり，PCBやPFOS環境化学物質を投与したマウスで、行動解析をおこなうとともに，パッチクランプ法により小脳プルキンエ細胞の細胞興奮性を観察した。その結果甲状腺機能低下やPCBの投与により多動や小脳失調が生じる事，また，甲状腺機能では主に平行線維シナプスからの神経伝達物質の放出が低下している可能性が高い事が明らかになった。
２）初代培養神経細胞を用い，ホルモンや環境化学物質による形態変化を解析した。そして甲状腺ホルモン受容体機機能の抑制により小脳プルキンエ細胞樹状突起伸展が抑制される事を明らかにした。また，培養小脳細胞においてPFOSが小脳プルキンエ細胞樹状突起の伸展を抑制する事が明らかになった。
３）in vivo 実験により発現変化した遺伝子のプロモーターの解析をおこない。特異的NR のエンハンサー領域の同定をめざした。特にNa-K ATPase遺伝子のプロモーター領域を用いて甲状腺ホルモン応答配列の同定を試みた。しかし，明らかな応答配列の同定までには至らなかった。一方、シナプス後膜に存在するアクチン結合タンパクが神経細胞の核にも存在し、NRを介する転写を調節している事を発見した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ホルモンを介する脳発達に関する基盤的研究に関しては，当初目的以上の達成度である。先天性甲状腺機能低下ラットであるrdwラットを用いた実験では論文を投稿する事ができた。また，小脳プルキンエ細胞特異的に甲状腺ホルモン作用を抑制したトランスジェニックマウスを用いた実験でも結果がまとまり、論文を投稿する事ができた。更に先天性甲状腺機能低下マウスを用いた実験でも投稿の目処をつけることができた。
一方、内分泌かく乱化学物質投与による脳発達の解析では，行動解析の条件設定に手間取り，結果は着実には出ているものの，分子基盤の解析や電気生理的な解析には必ずしも結びついていない点がやや問題であった。しかし、水酸化PCBの胎生期と授乳期の投与では生じる異常に差がある事、またラットとマウスでは生じる異常に種差がある事等を明らかにした（投稿準備中）。さらにPFOSの授乳期曝露でも行動異常を生じる可能性や小脳培養細胞おいて樹状突起の伸展を抑制する事などを明らかにした（投稿準備中）。これらの結果は次年度の研究発展につながるせいかであると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記の達成度を基に以下の研究を行う，
１） GFP 発現マウスで，行動解析，in vivo でのシナプス動態と神経伝達物質動態の長期的観察をおこなう，周産期にホルモン環境を変化させたり，環境化学物質を投与した動物での行動解析を，特にオペラント系を使って，高次脳機能を中心に調べる。また，行動が変化した動物を用いて，2 光子励起顕微鏡による，in vivo でシナプス動態の長期的観察を一部開始する。並行し，パッチクランプ法や顕微測光による神経細胞興奮性解析を開始する。
２）初代培養神経細胞を用い，ホルモンや環境化学物質による形態変化や興奮性を解析する。ホルモンや環境化学物質投与による形態変化と顕微測光による細胞興奮性を解析後、RNAを採取して標的となる遺伝子発現を調べる。
３） in vivo 実験により発現変化した遺伝子のプロモーターの解析をおこない。特異的NR のエンハンサー領域の同定をめざす。また，使用経験のない化学物質に対しては，in vitro実験でNR を介する転写調節への作用点を解析の後，上記in vivo 解析へとつなげる。現在使用していない化学物質の影響は継続的にレポーターアッセイなどで解析する。本年度はポリフェノールも解析の対象とする。
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