| 研究課題/領域番号 |
25281028
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
五十嵐 勝秀 国立医薬品食品衛生研究所, 毒性部, 室長 (30342885)
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| 研究分担者 |
大久保 佑亮 国立医薬品食品衛生研究所, 毒性部, 研究員 (80596247)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ゲノム / エピジェネティクス / 毒性試験 / レポーター / 有害化学物質 |
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| 研究概要 |
化学物質影響がゲノムに記憶されるエピジェネティック毒性の重要性が指摘されているが、そのリスクへの対応はほとんど進んでいない。その原因として、エピジェネティック毒性検出手法が高度な生化学解析技術を要するために毒性試験となじまず、毒性試験データからエピジェネティック毒性を検出することが容易ではないことがあげられる。本研究では、遺伝子組換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。それにより、通常の毒性試験時に高度な技術を必要とせずにエピジェネティック毒性の有無を判定できる「個体レベル評価システムの構築」を目指す。
本研究は、１）レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、２）培養細胞を用いた最適化、３）その結果を反映させたレポーターマウス作製、４）既知のDNA 脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の具体的な４つのステップに分けて実施する。
今年度は、本研究におけるレポーターマウス作製に必要なベクターの構築を優先的に実施した。
構築が必要なベクターは、(A)CAG-loxP-STOP-loxP-TetR, (B)TRE-LexA DB-Uhrf1-IRES-DsRed, (C)LexA_BSx8-Target-GFPの3種類が主である。これらのベクターを可能な限り迅速に構築することを目指したが、DNA断片の組み込みがうまくいかないステップが生じ、完成に至らなかった。遺伝子工学的基本技術の変更が必要と判断し、従来の「制限酵素によるDNA断片の調製とライゲーションによる断片挿入」ではなく、組み換え酵素を用いたDNA断片挿入手法を試したところ、良好にベクター構築を進められることが判明した。基本技術の限界による研究進捗の遅れが取り戻せる目処が立ったので、次年度は研究の進展が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では複雑な構成からなるベクターを複数種類作製することが必須である。理由は不明ながら、遺伝子工学的基本技術である「制限酵素によるDNA断片の調製とライゲーションによる断片挿入」では目的ベクターの構築が進まないステップにぶつかった。そのため、ベクター構築が遅れてしまったが、基本技術を見直し、組み換え酵素を用いたDNA断片挿入手法による改善に目処が立ったので、次年度以降は研究の順調な進行が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現時点ではベクター構築がなかなか進まないという課題に直面していたが、その克服に目処がついたので、次年度以降はスムーズに研究が進められると考えられる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度進めたベクター構築において、遺伝子工学的基本技術の壁にぶつかり、予定ベクターの完成に至らなかった。それらのベクターを用いた培養細胞での検討ステップは次年度に実施することとしたため、次年度使用額が生じた。
次年度は、組み換え酵素を用いたベクター構築を進め、進捗の遅れを取り戻す。そのための試薬購入に用い、培養細胞での最適化に必要な試薬類の購入にあてる予定である。
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