| 研究課題/領域番号 |
25281028
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| 研究機関 | 星薬科大学 |
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研究代表者 |
五十嵐 勝秀 星薬科大学, 付置研究所, その他 (30342885)
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| 研究分担者 |
大塚 まき 星薬科大学, 付置研究所, その他 (40734372)
山本 直樹 星薬科大学, 付置研究所, その他 (50757432)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ゲノム / エピジェネティクス / 毒性試験 / レポーター / 有害化学物質 |
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| 研究実績の概要 |
化学物質影響がゲノムに記憶されるエピジェネティック毒性の重要性が指摘されているが、そのリスクへの対応はほとんど進んでいない。その原因として、エピジェネティック毒性検出手法が高度な生化学解析技術を要するために毒性試験となじまず、毒性試験データからエピジェネティック毒性を検出することが容易ではないことがあげられる。本研究では、遺伝子組み換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。本研究は、1)レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、2)培養細胞を用いた最適化、3)その結果を反映させたレポーターマウス作製、4)既知のDNA脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の4つのステップに分けて実施する。
これまでレポーターマウス作製に必要なベクターの構築に際し、人工的に設計した標的配列に能動的にDNAメチル基を導入し続け、レポーター応答を抑える方針を採ってきた。しかしそれでは生体を反映しない特殊なDNAメチル化変化を捉えることになりかねないことから、生体を反映した標的配列を選択し直すこととした。そこでまず、imprint遺伝子由来のminimal promoterであるSnrpn promoterを検討したところ、近傍のメチル化状態と連動してメチル化変動しレポーター応答に反映可能である結果が得られた。このSnrpn promoterの上流に標的配列としてAgouti, Daz1のpromoter配列を連結し、培養細胞に導入し、Agoutiは中程度のレポーター応答、Daz1は弱いレポーター応答を示すことを確認した。そこでDNA脱メチル化物質アザシチジンに対する応答を検討したところ、ともにレポーター応答の増強を確認した。この結果を受け、レポーターマウス作製（外部委託）に移った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の最終目的は、化学物質によるDNAメチル化影響を組織において可視化可能なレポーターマウスを作製することである。本システムで用いるDNAメチル化を受ける特定の標的配列としてCpG配列を複数有する完全人工配列を予定し、必要なベクター構築を進めていたが、より生体を反映させるためには標的配列を選択し直した方がよいと判断した。そこでいくつかの候補配列を検討し、Snrpn promoterの活用に至った。標的配列を上流に連結したレポーターベクターを構築し、培養細胞を用いた検討でDNA脱メチル化物質であるアザシチジン処理により、レポーター応答が増強する結果が得られた。レポーターマウスの作製に移ることとしたが、所属研究機関にはレポーターマウスを作製する設備、技術者がいないため、外部委託することとした。現時点で委託作業の遅れもあり、レポーターマウスの必要最低限の解析まで至っていないため、本区分を選択した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、毒性研究において汎用性高く用いられるエピジェネティック毒性レポーターマウス作製を目指している。当初、レポーターシステムの標的配列として、CpG配列を複数有する完全人工配列を念頭に研究を進めていたが、毒性研究への応用を考えた場合、出来るだけ全身の細胞において発現する配列を選ぶ必要があるとの認識を強くし、標的配列の再選択を決断した。現在、基本候補配列としてSnrpn promoter配列、標的配列としてAgouti, Daz1を決定し、培養細胞と化学物質を用いた検証を終えた。作製を外部委託しているレポーターマウスの必要最低限の解析を加え、本マウスの有効性を広く成果報告する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の目的であるエピジェネティック毒性検出のためのレポーターマウス作製で最も重要な、「レポーター配列の検討・設計」に予定より時間を要した。その結果、トランスジェニックマウス作製の外部委託がずれ込み、最終年度内のマウス納品が間に合わない可能性が生じた。有用なレポーターマウスを完成させることが本研究に求められる成果であり、補助事業期間を延長させて頂き、本研究を完成させるために次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
レポーターマウス作製の外部委託費として、1,436,400円を予定。残りの1,230,699円は、本レポーターマウスのクローン選択、基本的解析およびそれに基づく成果報告費用として使用する。
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