| 研究課題/領域番号 |
25282024
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
林 久由 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (40238118)
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| 研究分担者 |
五十里 彰 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (50315850)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | Na依存性栄養素吸収 / タイト結合 / NHE3 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は摂取したNa+と栄養素吸収に必要なNa+が消化管で吸収されるどの様な関係になっているかを明らかにすることにある。また、これらの関係に上皮細胞間を構成するタイト結合部がどのように関与するのかを検討することにある。
小腸での栄養素吸収機構は、その駆動力であるNa+の依存の仕方により2つの機構に大別できる。1)グルコースなど多くの栄養素の吸収機構であり、細胞外液のNa+に依存し、栄養素と一緒に、一定の化学量論比でNa+が輸送される二次性能動輸送機構である。2)Na+に依存した二次性能動輸送体により形成された駆動力を使用する三次性の能動輸送であるペプチドなどの吸収機構である。これら2つの、それぞれの機構により栄養素と伴に吸収されるNa+の量比は異なると予想される。一方、食事由来のNaClは栄養素吸収に必要なNa+とは別に、同じ小腸上皮細胞で、別の機構である電気的中性のNaCl吸収機構によって吸収されていると考えられている。これらNa+の輸送経路には、輸送体を介した経細胞性経路と上皮細胞間を介する傍細胞経路の二つがある。にUssing チャンバー法を用い様々な条件下で栄養素と放射性同位元素である22Naを用い、栄養素吸収とNa吸収の量比を比較検討することで検討した。
また腸管Na+吸収機構とイオン輸送の傍細胞経路であるタイト結合の関与する分子を同定し、その機構を検討するため、低Na+食でマウスを飼育し、その際に腸管のどの部位でタイト結合を構成する蛋白質であるクロージンが変化するか否かをコントロール食群のマウスと比較検討を行った。またその分子機構の検討も細胞系を用いて検討を行った。更に、モデル動物を用い、食性とNa+依存性栄養素吸収機構の関連を検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、栄養素吸収に必要な多量のNaが、どのように腸管で賄われており、またそれが、摂取したNaと、どのような機構で区別されているのかを明らかにすることである。Na依存性のグルコース機構の関係を摘出したマウス小腸を用いて、22Naのフラックスを経上皮電位差が発生しない短絡条件下と非短絡条件下で測定した。短絡条件下ではグルコース吸収に伴い、22Naの吸収性のフラックスが観察されたが、非短絡条件下では22Naの吸収性のフラックスは観察されなかった。この理由としては、栄養素吸収に伴い管腔側が負電位の発生により、傍細胞経路を介し、Naが管腔側に戻っている可能性が示唆された。このため、傍細胞経路の陽イオン透過性に重要な役割をしているクロージン15を欠失させたマウスを用いて検討を行った。クロージン15ノックアウトマウスでは非短絡条件下でも野生型では観察されなかった22Naの吸収性のフラックスがグルコース吸収に伴い観察された。しかし、理由は不明ではあるが実験の再現性が低く、最終的な結論には到達できていない。ペプチド吸収機構とNaに関してはクロージン15の欠損により、NHE3の調節タンパク質であるNHERFの発現が低下し、NHE3の機能活性化が低下していることが示唆された。またカエルをモデル動物として、食性と腸管Na代謝の変化を観察した。オタマジャクシは草食でNa摂取量がほとんどないにもかかわらず、腸管内は高いNa濃度が維持されていることが明らかになり、またNa依存性のグルコース機構が肉食のカエルと略同等であることが明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの到達度がやや遅れている大きな理由は、ノックアウトマウスが年間に10匹程度しか使用できないことと、野生型と比較すべきノックアウトマウスでのUssing chamber法で再現性が乏しいことが大きい。Ussing chamber法では上部小腸が標本として適さないことが、本研究室での経験や、他の研究室でも以前から知られていたが、その理由については不明のままである。野生型マウスについては一昨年度から、上部小腸の標本を用いて研究を行っているいくつかの研究室とコンタクトをとり、手法等を改善し、空腸では再現性よく測定することが可能となったが、まだ十二指腸では測定できていない。また、この部位ではマウスを用いたin vivoの実験条件ではNa+依存性の栄養素吸収活性が一番高いことを観察しており、in vitroのUssing chamber法で定量的な解析を行う必要がある。4月に米国で本研究成果を発表した際に、ラットの十二指腸でグルコース誘発短絡電流を測定しているグループと討論を行った。このグループでは以前は同様の問題があったが、いくつか改善すること測定が可能になったため、この手法をマウス小腸で検討を行う。野生型マウスの十二指腸で測定が可能になった場合は、ノックアウトマウスでも同様に検討を行う。年間の匹数は施設の関係で改善がされないため、効率的に実験ができるように考慮する。
またマウスだけでは、研究が十分に進まないことが予測されるため、昨年度から食性とNa依存性栄養素吸収の関係を、モデル動物としてカエルを用いて行っており、食性の変化と腸管内のNa代謝に関して興味深い知見を得ている。このため、腸管Na代謝の生物学的意義を検討するために、どの様な機構が関与しているかを明らかにするために電気生理学に拡散電位測定また関与する分子に関してはリアルタイムPCR法を用い検討を行う。
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