研究課題
本研究では、in vitroで膜蛋白質をスクリーニング可能な技術Liposome display法を確立し、これを利用した膜蛋白質の実験室内機能進化を行うことを目的とする。この手法では、細胞サイズのリポソーム内で無細胞翻訳系を用いて1分子のDNAから膜蛋白質を機能発現可能な形で合成し、さらに合成された膜蛋白質の機能評価を行う必要がある。機能評価法の違いにより、Liposome display法には大きくわけて2つの方法、(1)FACS-base法と(2)panning-based法が考えられる。FACS-based法では、膜蛋白質の機能評価を蛍光セルソーター(FACS)により行うのに対して、panning-based法では、膜タンパク質が特定のリガンドに結合する能力を指標としてスクリーニングを行う。2014年度は、FACSを用いた実験系の確立を目指した。具体的には、大腸菌由来多剤排出トランスポーターの1つであるEmrEをモデル膜タンパク質として用い、野生型のEmrEと機能欠失変異体E14Cの遺伝子の混合物から野生型の遺伝子を濃縮する実験条件の確立を目指した。その結果、10-30倍程度の濃縮効率を達成できた。このように、目的の膜蛋白質遺伝子を特異的に選択できる条件を見出した。2013年度には、リポソーム内膜蛋白質合成系へのトランスロコンの導入に成功した。これにより、Liposome display法が適用可能な膜タンパク質のバラエティーが増加することが期待される。2014年度は、トランスロコンによる膜蛋白質の膜挿入効率の定量解析を行った。大腸菌由来のSecトランスロコンを用いることでEmrEの膜への呈示率、EtBrの輸送活性ともに３倍程度向上していることを明らかにした。この結果は、導入したSecトランスロコンが予想通りの働きをしていることを示唆している。
2: おおむね順調に進展している
2014年度は、FACS-base法を確立すること、トランスロコンの導入の効果の定量解析を実施し、共に達成できた。よって、予定通り達成できているため、順調に進展していると考えている。
＜トランスロコンの導入とその拡張性の検証＞2014年度までに、EmrEをモデルタンパク質として用いリポソーム内膜蛋白質合成系へトランスロコンを導入し、その動作性を確認した。そこで2015年度は、この実験系の拡張性を検討する。すなわち、トランスロコンを導入によりLiposome display法が適用可能な膜タンパク質のバラエティーが増加したのかを検証する。具体的には、大腸菌の膜タンパク質遺伝子を多数用意し、構築したトランスロコンにより膜挿入効率が向上するのかを検討する。＜Liposome display法を用いた実験室進化実験＞2014年度までで構築した手法を用いてEmrE変異体の創出を目指す。具体的には、EmrEにランダム変異導入し、liposome display法を用いてEmrEの高機能変異体を創成する。
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すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 3件) 備考 (1件)
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