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2015 年度 実績報告書

無細胞翻訳系を用いた膜タンパク質進化分子工学的手法の開発と応用

研究課題

研究課題/領域番号 25282239
研究機関大阪大学

研究代表者

松浦 友亮  大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50362653)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード進化分子工学 / 無細胞翻訳系 / 膜タンパク質 / リポソーム
研究実績の概要

本研究では、in vitroで膜蛋白質をスクリーニング可能な技術Liposome display法を確立し、これを利用した膜蛋白質の実験室内機能進化を行うことを目的とする。本年度は、これまでに確立した技術を用いてEmrEの進化分子工学を試みた。
大腸菌由来の多剤排出トランスポーターEmrEは複数の毒性化合物を認識できるというユニークな性質を持ち、100アミノ酸程度と小さい上に配向性を持たないという工学利用に有利な性質を有している。EmrEはその特性から生体毒物を検出するバイオセンサー素子として有望であると考えているが、基質との親和性が弱い問題があった。
野生型のEmrEにランダム変異を導入したライブラリーを構築し、これを細胞サイズのリポソーム内で無細胞翻訳系を用いて1分子のDNAから膜蛋白質を機能発現可能な形で合成し、さらに合成された膜蛋白質の機能評価をセルソーターで行った。機能としてはEtBrの輸送活性を指標とし、より多くのEtBrを取り込んだリポソームを分取した。このようなスクリーングを3回繰り返し行った結果、野生型EmrEよりも機能が高い遺伝子プールの取得に成功した。
前年度までに、EmrEをモデルタンパク質として用いリポソーム内膜蛋白質合成系へトランスロコンを導入し、その動作性を確認した。そこで2015年度は、この実験系の拡張性を検討した。すなわち、トランスロコンを導入によりLiposome display法が適用可能な膜タンパク質のバラエティーが増加したのかを検証した。具体的には、大腸菌の膜タンパク質遺伝子を多数用意し、構築したトランスロコンにより膜挿入効率が向上するのかを検討した。その結果、テストした9種の膜タンパク質のうち7種類でトランスロコンによる膜挿入効率の向上が観測された。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

27年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件、 招待講演 4件)

  • [雑誌論文] Liposome-Based in Vitro Evolution of Aminoacyl-tRNA Synthetase for Enhanced Pyrrolysine Derivative Incorporation2015

    • 著者名/発表者名
      Uyeda, A., Watanabe, T., Kato, Y., Watanabe, H., Yomo, T., Hohsaka, T. and Matsuura, T.
    • 雑誌名

      Chembiochem

      巻: 16 ページ: 1797-802

    • DOI

      10.1002/cbic.201500174

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] In vitro directed evolution of alpha-hemolysin by liposome display2015

    • 著者名/発表者名
      Fujii, S., Matsuura, T. and Yomo, T.
    • 雑誌名

      Biophysics

      巻: 11 ページ: 67-72

    • DOI

      10.2142/biophysics.11.67

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Membrane Curvature Affects the Formation of alpha-Hemolysin Nanopores2015

    • 著者名/発表者名
      Fujii, S., Matsuura, T. and Yomo, T.
    • 雑誌名

      ACS Chem Biol

      巻: 10 ページ: 1694-701

    • DOI

      10.1021/acschembio.5b00107

  • [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を用いた膜タンパク質進化分子工学2016

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      第4回 ネオバイオ分子研究会
    • 発表場所
      大阪府立大学I-site なんば・大阪市
    • 年月日
      2016-01-29 – 2016-01-29
    • 招待講演
  • [学会発表] バイオ界面を利用したin vitro進化分子工学2015

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      日本生物工学会第67回大会
    • 発表場所
      城山観光ホテル・鹿児島市
    • 年月日
      2015-10-26 – 2015-10-28
    • 招待講演
  • [学会発表] 無細胞タンパク質合成系を用いた膜タンパク質進化分子工学2015

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      第15回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      あわぎんホール, 徳島市
    • 年月日
      2015-06-24 – 2015-06-26
    • 招待講演
  • [学会発表] In Vitro Selection and Evolution of Membrane Proteins” Gordon Research Conferences in Proteins2015

    • 著者名/発表者名
      Tomoaki Matsuura
    • 学会等名
      Gordon Research Conferences in Proteins
    • 発表場所
      Boston, U.S.A.
    • 年月日
      2015-06-15 – 2015-06-20
    • 国際学会 / 招待講演

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公開日: 2017-01-06  

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