| 研究課題/領域番号 |
25288075
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
藤井 紀子 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (90199290)
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| 研究分担者 |
加治 優一 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50361332)
大神 信孝 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80424919)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | D-アミノ酸 / 老化 / 蛋白質異常凝集 / 解離 |
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| 研究実績の概要 |
蛋白質はL-アミノ酸のみから構成されているために正しい折りたたみ構造を形成し、その機能を発揮している。しかし、近年、白内障、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、加齢性難聴等、種々の加齢性疾患の原因蛋白質中にD-β-アスパラギン酸（Asp）が蓄積していることが明らかとなってきた。蛋白質中にD-β-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、蛋白質の変性や異常凝集が起こる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化、ならびに断片化→蛋白質の不溶化に至るが共通して生じている。本研究では蛋白質中でのD-β-Asp生成を加齢性疾患発症の一因と捉え、D-β-Asp含有蛋白質の微量定量分析の画期的な開発を行った。これにより、迅速、簡便な結合型D-アミノ酸分析が実現できた。また、水晶体蛋白質中の主成分であるα-クリスタリンにD-Aspが生成されると会合体として保持できず、解離することが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
1）老人性白内障の水晶体をホモジェナイズし、遠心処理後、蛋白質を精製することなく、トリプシン処理し、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)により、クリスタリン中のどのAsp残基がどの程度D-β-体化しているのかを微量試料で、簡便、迅速、精確に定量することに成功した。
2）蛋白質中に生ずるAsp残基の異性体はLα, Dα, Lβ-, Dβ-体の4種類存在する。これらは互いにジアステレオマーであるためにLC上で分離する。従って同一質量でLC上で複数のピークに分離しているペプチドがAsp異性体含有ペプチドであるので、この性質を利用して異性体の発見に成功した。これらのペプチドの同定は当初、4種類のAsp異性体を導入したペプチドを標品として化学合成し、その溶出時間を比較することにより決定していたが、時間とコストがかかることから、本年はAsp異性体を特異的に認識する酵素を作用させ、4種類の異性体の同定に成功した。
3）老人性白内障のα-クリスタリン、β-クリスタリンは通常、会合体を形成しているが、これらのクリスタリンはAsp残基が異性化することにより、会合体として存在できず、解離して単量体になることが初めて明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究推進の成否は蛋白質中のD-β-Asp残基の分析をいかに、簡便に、精度よく、迅速に行うかにかかっている。従来法では蛋白質を精製し、酵素によってペプチドに断片化し、それらペプチドを加水分解し、ジアステレオマー法によってアミノ酸の光学異性体分析を行っていた。この分析法は時間がかかり、多くの試料の分析に適さない。そこで、今回、LC-MSと市販酵素の組み合わせにより、従来法とは全く異なる迅速簡便な定量法を確立させた。それにより従来分析が困難であった不溶蛋白質の分析も可能となった。この方法を利用し、他の加齢性疾患の蛋白質中のD-β-Asp残基を検出し、疾患の度合いとの関連について研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の主力機器である液体クロマトグラフ質量分析装置のカラム、消耗品を本年度予算で購入の予定であったが、いずれも高価であるため、本年度は古いものでも使用可能であったので、これを購入しなかった。また、故障の際の多額の修理代も考慮していたが、今年度の維持、修理代は少額であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
27年度以降、必要な時期に交換すべき消耗品を購入し、分析の向上を目指す。また、引き続き、使用期限がある消耗品の更新代を確保する。
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