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2013 年度 実績報告書

大脳皮質神経細胞へのシナプス入力の定量的解析

研究課題

研究課題/領域番号 25290012
研究種目

基盤研究(B)

研究機関生理学研究所

研究代表者

窪田 芳之  生理学研究所, 大脳皮質機能研究系, 准教授 (90192567)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2017-03-31
キーワード大脳皮質 / シナプス / 棘突起 / gephyrin / PSD95 / in vivo
研究概要

ラットの胎児の大脳皮質前頭部に、プラスミド(錐体細胞をYFPで標識、PSD95(興奮性シナプス後膜物質)をmCherryで標識、GEPHYRIN(抑制性シナプス後膜物質)をTEAL (CFP)で標識するように設計したコンストラクト)を電気穿孔法(エレクトロポレーション、IUE)で入れて、出産させた。動物が成熟してから灌流固定し、その後に50μm厚の脳切片を組織処理して、レーザーコンフォーカルで観察し、YFPで標識された錐体細胞上にあるPSD95とGEPHYRINのラベルされた固まり(小さい点: punctate)を観察した。コンストラクトの最適濃度を試行錯誤の上で見出そうとしたが、GEPHYRINのラベルがうまく行かなかった。そこで、錐体細胞をYFPで標識するように設計したコンストラクトのみをIUEで入れて、出産させた後、免疫組織化学法で、興奮性シナプス後部のマーカーとしてPSD95、抑制性シナプス後部のマーカーとしてGEPHYRIN抗体で処理し、レーザーコンフォーカルで観察し、YFPで標識された錐体細胞上にあるPSD95とGEPHYRINの点(punctate)を観察した。2/3層の錐体細胞を手始めに、抑制性シナプスと興奮性シナプスの密度解析を開始した。レーザーコンフォーカル顕微鏡で神経細胞の全体像をフォーカスを変えて撮影し、それをNeurolucidaで解析して樹状突起の立体的再構築を行った。細胞体からの距離に応じて、シナプス密度がどのように変化するか、現在解析を開始した。また、樹状突起が位置する層によりシナプス入力密度が変化するかどうかも解析した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

コンストラクトをIUEで胎児の脳に注入するのは、Embrionic 14日から15日である。1週間程で出生した時点で、YFPが錐体細胞に入っているかどうかのチェックは可能である。シナプスのマーカーがうまく発現しているかどうかは、さらに6週令になるまで成長を待ち、還流固定して脳を切片にし、レーザーコンフォーカル顕微鏡で観察して初めてIUEで胎児の脳に注入するコンストラクト濃度の良し悪しが判断できる。従って、実験のフィードバックに時間がかかってしまった為、予定よりもやや遅れ気味である。

今後の研究の推進方策

引き続き、IUEでYFPを入れる事でラベルした錐体細胞に免疫組織化学法でPSD95とGEPHYRINをラベルしシナプスの密度計測を行い、定量的なデータを集める予定である。また、興奮性シナプスと抑制性シナプスの機能的な動態をin vivo imaging法を使って解析する。

次年度の研究費の使用計画

米国から直接ウルトラミクロトームを購入した。その為替の変動が支払い価格と輸入関税に影響し、予定価格よりも支払い金額が少なくなり、その事により次年度使用額が少しではあるが生じた。また、3月26-29日に学会出張したが、その出張費の計算は年度内に完了したが、実際の支払いが次年度に行われたため、次年度使用額が生じた。
来年度の予算とあわせて物品を購入する予定である。また、出張費は次年度初頭に支払われた。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2014 2013 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 8件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Untangling GABAergic wiring in the cortical microcircuit2014

    • 著者名/発表者名
      Yoshiyuki Kubota
    • 雑誌名

      Current Opinion in Neurobiology

      巻: 26 ページ: 7-14

    • DOI

      10.1016/j.conb.2013.10.003

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Cortical NO interneurons: from embryogenesis to functions2014

    • 著者名/発表者名
      Tricoire L, Kubota Y, Cauli B
    • 雑誌名

      Front Neural Circuits

      巻: 7 ページ: 105

    • DOI

      10.3389/fncir.2013.00105. eCollection 2013.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons2013

    • 著者名/発表者名
      DeFelipe J,….. Jones EG, Kawaguchi Y, Kubota Y, ……. YusteR & Ascoli GA合計42名
    • 雑誌名

      Nature Reviews Neuroscience

      巻: 14 ページ: 202-216

    • DOI

      10.1038/nrn3444.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Functional Significance of Rall’s Power of Three Halves Law in Cortical Nonpyramidal Cells2013

    • 著者名/発表者名
      Kubota Y, Nomura M, Karube F, and Kawaguchi Y
    • 雑誌名

      Advances in Cognitive Neurodynamics (III)

      巻: 3 ページ: 45-51

    • DOI

      10.1007/978-94-007-4792-0_7.

    • 査読あり
  • [学会発表] TEM, FIB/SEM, DiK-SEMを使った神経組織の電子顕微鏡連続切片作製2014

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      自治医科大学、小山市、栃木県
    • 年月日
      20140327-20140329
    • 招待講演
  • [学会発表] TEM, FIB/SEM, DiK-SEMを使った神経組織の電子顕微鏡連続切片作製2014

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      第91回日本生理学会大会
    • 発表場所
      鹿児島大学、鹿児島市、鹿児島県
    • 年月日
      20140316-20140318
    • 招待講演
  • [学会発表] Differences in size of cortical synapses underly distinct modes of inhibitory control2013

    • 著者名/発表者名
      Kubota Y, Kondo S, Nomura M, Karube F, Luebke J and Kawaguchi Y
    • 学会等名
      43rd annual meeting of the Society for Neuroscience
    • 発表場所
      San Diego convention center, San Diego, U.S.A.
    • 年月日
      20131109-20131113
  • [学会発表] Locally limited conductance of IPSCs elicited by cortical fast spiking basket cell2013

    • 著者名/発表者名
      Yoshiyuki Kubota, Satoru Kondo, Masaki Nomura and Yasuo Kawaguchi
    • 学会等名
      Cell Symposia "The Networked Brain"
    • 発表場所
      San Diego Hilton, San Diego, U.S.A.
    • 年月日
      20131107-20131108
  • [学会発表] 大脳皮質非錐体細胞の樹状突起の形態解析2013

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      第54回日本組織細胞化学会総会・学術集会
    • 発表場所
      航空会館、東京、東京都
    • 年月日
      20130927-20130928
    • 招待講演
  • [学会発表] Locally limited conductance of IPSC elicited by fast spiking interneurons synapsing onto cortical pyramidal cell2013

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      第6回国際神経回路会議 - Functional Mechanism of Cortical Microcircuit
    • 発表場所
      岡崎コンファレンスセンター、岡崎市、愛知県
    • 年月日
      20130624-20130626
    • 招待講演
  • [学会発表] Locally limited conductance of IPSC elicited by fast spiking interneurons synapsing onto cortical pyramidal cell2013

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      第36回日本神経科学会大会
    • 発表場所
      京都国際会館、京都市、京都府
    • 年月日
      20130620-20130623
    • 招待講演
  • [学会発表] 電子顕微鏡連続切片の再構成による大脳皮質抑制性神経細胞の特徴抽出

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      IIRSセミナー
    • 発表場所
      東京大学、東京、東京都
    • 招待講演
  • [学会発表] 樹状突起分岐部の微小管のFIB/SEMによる観察

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会「様々な極微イメージング技術研究部会」第1回研究会
    • 発表場所
      久留米大学、久留米市、福岡県
    • 招待講演
  • [学会発表] 大脳皮質FSバスケット細胞から錐体細胞への 抑制性シナプス結合特性

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 学会等名
      Frotier BioScience Colloquium
    • 発表場所
      大阪大学生命機能研究科、吹田市、大阪府
    • 招待講演
  • [図書] 3次元構築と立体画像(岡部繁男編集) ライフサイエンス顕微鏡学ハンドブック2014

    • 著者名/発表者名
      窪田芳之
    • 総ページ数
      299
    • 出版者
      朝倉書店

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公開日: 2015-05-28  

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