| 研究課題/領域番号 |
25290012
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
窪田 芳之 生理学研究所, 大脳皮質機能研究系, 准教授 (90192567)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 大脳皮質 / シナプス / 棘突起 / gephyrin / PSD95 / in vivo |
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| 研究概要 |
ラットの胎児の大脳皮質前頭部に、プラスミド（錐体細胞をYFPで標識、PSD95（興奮性シナプス後膜物質）をmCherryで標識、GEPHYRIN（抑制性シナプス後膜物質）をTEAL (CFP)で標識するように設計したコンストラクト）を電気穿孔法（エレクトロポレーション、IUE）で入れて、出産させた。動物が成熟してから灌流固定し、その後に50μm厚の脳切片を組織処理して、レーザーコンフォーカルで観察し、YFPで標識された錐体細胞上にあるPSD95とGEPHYRINのラベルされた固まり（小さい点: punctate）を観察した。コンストラクトの最適濃度を試行錯誤の上で見出そうとしたが、GEPHYRINのラベルがうまく行かなかった。そこで、錐体細胞をYFPで標識するように設計したコンストラクトのみをIUEで入れて、出産させた後、免疫組織化学法で、興奮性シナプス後部のマーカーとしてPSD95、抑制性シナプス後部のマーカーとしてGEPHYRIN抗体で処理し、レーザーコンフォーカルで観察し、YFPで標識された錐体細胞上にあるPSD95とGEPHYRINの点（punctate）を観察した。2/3層の錐体細胞を手始めに、抑制性シナプスと興奮性シナプスの密度解析を開始した。レーザーコンフォーカル顕微鏡で神経細胞の全体像をフォーカスを変えて撮影し、それをNeurolucidaで解析して樹状突起の立体的再構築を行った。細胞体からの距離に応じて、シナプス密度がどのように変化するか、現在解析を開始した。また、樹状突起が位置する層によりシナプス入力密度が変化するかどうかも解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コンストラクトをIUEで胎児の脳に注入するのは、Embrionic 14日から15日である。１週間程で出生した時点で、YFPが錐体細胞に入っているかどうかのチェックは可能である。シナプスのマーカーがうまく発現しているかどうかは、さらに６週令になるまで成長を待ち、還流固定して脳を切片にし、レーザーコンフォーカル顕微鏡で観察して初めてIUEで胎児の脳に注入するコンストラクト濃度の良し悪しが判断できる。従って、実験のフィードバックに時間がかかってしまった為、予定よりもやや遅れ気味である。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、IUEでYFPを入れる事でラベルした錐体細胞に免疫組織化学法でPSD95とGEPHYRINをラベルしシナプスの密度計測を行い、定量的なデータを集める予定である。また、興奮性シナプスと抑制性シナプスの機能的な動態をin vivo imaging法を使って解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
米国から直接ウルトラミクロトームを購入した。その為替の変動が支払い価格と輸入関税に影響し、予定価格よりも支払い金額が少なくなり、その事により次年度使用額が少しではあるが生じた。また、３月26-29日に学会出張したが、その出張費の計算は年度内に完了したが、実際の支払いが次年度に行われたため、次年度使用額が生じた。
来年度の予算とあわせて物品を購入する予定である。また、出張費は次年度初頭に支払われた。
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