| 研究課題/領域番号 |
25290022
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
塩坂 貞夫 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90127233)
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| 研究分担者 |
宮井 和政 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60283933)
板東 良雄 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (20344575)
石川 保幸 前橋工科大学, 工学部, 准教授 (90346320)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 天然基質 / 神経可塑性 / 認知機能 / プロテアーゼ / 組織プラスミノーゲンアクティベータ / tPA / neuropsin |
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| 研究概要 |
tPA、トロンビン、ニューロトリプシンおよびカリクレイン６はいずれも脳に存在するセリンプロテアーゼ群であり、構造的にもよく類似している。そこで我々はニューロプシンにおいてすでに実用化したDirect-protease-substrate interaction(Dips法)による天然基質候補のスクリーニングを行った(参考：Tamura et al. J. Neurosci. 32:12657,2012)。
作製する結合能維持変異型プロテアーゼは各プロテアーゼのLoop Gの一部を変異させたExpression vectorを作製する。この作業は後述するそれぞれの担当者が各大学で行う。いずれも数種類の変異遺伝子を作製し、結合能維持変異型プロテアーゼが出来たかどうかは細胞への遺伝子導入を行い、ウェスタン法によってプロテアーゼの理論分子量より大きいコンプレックスが出来たものを候補とする。この研究では適切な変異プロテアーゼを得ることが条件であり、カリクレイン６、トロンビンはLoopGの構造がきわめてよく類似し(Kishi et al. J. Biol. Chem. 274, 4220,1999)、ジスルフィド結合を作るC208は保存されているため、これを解くため同様にC208S変異を導入する。しかしコンプレックスが出来ない場合には僅かに位置を変え検討する。
②基質複合体の質量分析検索
これらの内いくつかについてコンプレックスが出来れば、それを優先して解析を進める。こうして得られたコンプレックスはMycあるいはHis-tagによって分離することが容易である。得られた高分子コンプレックスをTof-Mass解析を行う（基質スクリーニング）。Tof-Mass解析については奈良先端科学技術大で行い、分析結果を分担者と共有する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
組織プラスミノーゲンアクティベータ（ｔＰＡ）ミュータントの作成、すなわち基質に結合するがそれを切断分離することのないミュータントリコンビナントタンパク質の作成、に成功し、代表的な基質とされているプラスミノーゲンを結合させることによって確かめた。また、マウスのみならずヒト型タンパク質についても同様に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ｔＰＡについてミュータントリコンビナントタンパク質の作成に成功したので、血漿タンパク質および脳ホモジェネートを用いて、コンプレックスを作成し、この結合タンパク質をＭｙｃあるいはＨｉｓＴａｇによる免疫沈降などによって分離して、ＭＡＳＳによる検討を行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
石川准教授は平成25年3月31日に奈良先端科学技術大学院大学より前橋工科大学の准教授として異動した。そのため、最初の4か月は研究室の準備に忙殺され、当初の計画に沿った研究ができなかった。そのため、370,368円の未使用研究費が生じた。平成26年度は計画に沿った使用が可能である。
370,368円の次年度繰越額に平成26年度配分額加えて、870,368円配分される。
物品費（抗体など）、870,368円の使用を予定している。
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