ラット多能性幹細胞を利用した臓器欠損モデルの作製と胚盤胞補完法による臓器再生

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25290037
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: CRISPR/Cas9法 / Foxn1遺伝子 / ノックアウトラット / マウスES細胞 / 胸腺 / 胚盤胞補完法 / GFP / 末梢血T細胞

研究実績の概要

胚盤胞補完法を利用した臓器欠損モデルにおける臓器再生とその応用
再生医療分野では、異種動物体内でiPS細胞由来臓器を再生する技術が注目されている。具体的には、臓器形成に関わる遺伝子をノックアウト (KO) することにより発生過程のニッチ (臓器の空き) を作り、胚盤胞期胚に顕微注入したES/iPS細胞がそのニッチに寄与することで臓器が再生されるという原理で、これを胚盤胞補完法という。本年度は、胸腺発生遺伝子のひとつであるFoxn1をCRISPR/Cas9法によりKOしたラットにおいて、44塩基 (bp) 欠失、60bp欠失、および44bp/60bp欠失のホモ個体を作出した。致死のタイミング、無毛の程度、胸腺の有無、および末梢血T細胞の割合を調べた結果、44 bp /44 bp、60 bp /60 bp、あるいは44 bp /60 bpのいずれかのホモ欠失個体は胸腺が欠損していた。しかし完全な無毛ではなく、それらの分娩能力や哺育能力は正常だった。ホモ欠失個体の末梢リンパからはT細胞が著しく減少していた一方、B細胞やNK細胞の量は野生型ラットと同程度だった。また、60 bp /60 bp欠失個体は生後間もなく死亡することが明らかになった。次に、マウスES細胞を用いた胚盤胞補完によって胸腺欠損ラット体内にマウス胸腺を再生させようとした。ホモKOラット由来胚盤胞の胞胚腔に全身性にGFPを発現するマウスES細胞を顕微注入したところ、得られた産仔はホモKOラットであるにもかかわらず強いGFP陽性を示す胸腺が存在し、末梢血の解析によりCD3陽性の細胞集団が認められた。つまり、ラット体内で再生された胸腺が機能し、ラットT細胞の分化を誘導したと考えられる。以上、胸腺欠損ラット体内でマウスES細胞に由来する胸腺を再生することに成功し、再生胸腺が正常に機能し得ることが示唆された。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Hypomorphic phenotype of Foxn1 gene-modified rats by CRISPR/Cas9 system. (2016)
  • 著者名/発表者名: Goto T, Hara H, Nakauchi H, Hochi S, Hirabayashi M
  • 雑誌名: Transgenic Res. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s11248-016-9941-9
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Transgenic rat model of childhood-onset dermatitis by overexpressing telomerase reverse transcriptase (TERT). (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaneko R, Sato A, Hamada S, Yagi T, Ohsawa I, Ohtsuki M, Kobayashi E, Hirabayashi M, Murakami T
  • 雑誌名: Transgenic Res. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s11248-016-9939-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rat blastocysts from nuclear injection and time-lagged enucleation and their commitment to embryonic stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Goto T, Takizawa A, Sanbo M, Jacob HJ, Kobayashi T, Nakauchi H, Hochi S, Hirabayashi M
  • 雑誌名: Cell. Reprogram. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1089/cell.2015.0084.
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Lack of pulse and surge modes and glutamatergic stimulation of luteinising hormone release in Kiss1 knockout rats. (2015)
  • 著者名/発表者名: Uenoyama Y, Nakamura S, Hayakawa Y, Ikegami K, Watanabe Y, Deura C, Minabe S, Tomikawa J, Goto T, Ieda N, Inoue N, Sanbo M, Tamura C, Hirabayashi M, Maeda KI, Tsukamura H
  • 雑誌名: J. Neuroendocrinol. 巻: 27 ページ: 187-197
  • DOI: 10.1111/jne.12257
  • 査読あり
• [雑誌論文] Knock-in of a histone H2B-tdTomato reporter into the Rosa26 locus allows visualization of cell nuclei in rats. (2015)
  • 著者名/発表者名: GotoT, Kobayashi T, Hara H, Sanbo M, Hochi S, Nakauchi H, Hirabayashi M
  • 雑誌名: Mol. Reprod. Dev. 巻: 82 ページ: 916-917
  • DOI: 10.1002/mrd.22584
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] ドナー核注入後に時間をおいて除核する方法で作製したラットクローン胚盤胞 (2015)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真, 滝澤 明子, 後藤 哲平, 三宝 誠, 小林 俊寛, 中内 啓光, 保地 眞一, 平林 真澄.
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 宮崎大学木花キャンパス （宮崎県宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] 臓器再生に向けたCRISPR/Cas9法による腎臓欠損ラットの作出 (2015)
  • 著者名/発表者名: 後藤 哲平, 原 弘真, 保地 眞一, 平林 真澄.
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 宮崎大学木花キャンパス （宮崎県宮崎市）
  • 年月日: 2015-09-17
• [学会発表] Production of cloned rat blastocysts with CAG/Venus-transgenic donor cells and Rosa26-H2B/tdTomato knock-in recipient oocytes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Takizawa A, Goto A, Sanbo M, Kobayashi T, Nakauchi H, Hochi S, Hirabayashi M.
  • 学会等名: The 48th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction
  • 発表場所: Puerto Rico Convention Center (プエルトリコ,U.S.A.)
  • 年月日: 2015-06-20
  • 国際学会
• [学会発表] CRISPR/Cas9法により作出したFoxN1遺伝子ノックアウトラットの解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 後藤 哲平, 原 弘真, 保地 眞一, 平林 真澄.
  • 学会等名: 第62回日本実験動物学会
  • 発表場所: 京都テルサ (京都府京都市)
  • 年月日: 2015-05-29
• [備考] 遺伝子改変動物作製室ホームページ
  • URL: http://www.nips.ac.jp/mamtg/