| 研究課題/領域番号 |
25290038
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
米川 博通 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 研究員 (30142110)
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| 研究分担者 |
吉川 欣亮 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, プロジェクトリーダー (20280787)
設楽 浩志 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 基盤技術研究職員 (90321885)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ジフテリア毒素受容体 / 遺伝子改変マウス / 細胞特異的破壊法 / 中枢神経系 / ヒト疾患モデルマウス / Recombineering |
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| 研究概要 |
本研究は、これまで我々が行なってきた毒素受容体仲介性細胞特異的破壊法（TRECK)法をさらに進展させ、複数の組織特異的プロモータを用いて、より特性の高いTRECK法を樹立するために計画したものである。
今年度は、初年度のため、特に本研究に必要なBACクローンの蒐集、改変TRECKベクターの構築、改変TRECKベクターを用いた、改変BACクローンの構築を行なった。
研究の進捗状況は以下の通りである。１）BACクローンの蒐集、Nestin、CamKII等の蒐集、単クローン精製、DNA抽出を行ない、in vitro BAC改変法（Recombineering)の材料を準備した。２）従来のTRECKベクターにtdTomato遺伝子を導入した改変TRECKベクターを構築し、3T3細胞を利用したin vitroでの形質転換を行ない、tdTomatoの発現を確認した。さらにloxP配列で挟んだAzami Green遺伝子を導入し、そのin vitroでの形質転換によるAzami Greenの発現と、Cre/loxPシステムが正常に機能するか否かの確認を行なう実験を計画している。３) Recombineeringに必要なGalK置換BACを作製するため、Nestin、CamKII等のBACの第1エクソン部分をGalKで置換したBACを作製し、成功した。４）２）の改変TRECKベクターをGalK置換BACクローンに導入・置換するためのベクターの構築を行なった。現在、その改変BACを獲得するための実験を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度までに、改変TRECKベクターを用いた改変BACクローンを完成し、トランスジェニックマウスを作製する予定であったが、通常のRecombineeringで使用するDNA組換え体に比較して、DNA長が3～5倍程度長かったため、通常のRecombineeringで使用する相同組換え領域のDNA長ではうまく行かなかった。そのため、最終段階でかなりの時間を費やしてしまい、トランスジェニックマウス作製までに至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画自体に変更点はない。現在、進捗が遅れている改変TRECKベクターを用いた改変BACクローンを獲得するために、様々な条件検討を行なっている。できるだけ早期にこの問題点を解決し、改変BACクローンの獲得を行ない、今年度の遅れを取り戻して、次年度の研究計画が達成できるようにしたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は、Tgマウスの作製に至らなかったため、その費用分に剰余分が出てしまったため。
次年度、Tgマウス作製の費用に組み入れる。
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