| 研究概要 |
ヒト正常線維芽細胞株（TIG-3, Hs68, IMR90）、ヒト正常上皮細胞株（RPE, NHEK, NHEM）、マウス正常線維芽細胞株（MEF）を継代培養するか、もしくは活性化型Rasの過剰発現やDNA損傷ストレス（X線照射）によって細胞老化を誘導し、48時間培養した上清を回収し、超遠心法でエクソソームを分離後にNanoSightを用いて回収したサンプルの粒子径を測定すると同時に、透過型電子顕微鏡（TEM）観察を行いエクソソームが回収されていることを確かめた。この時、細胞老化をおこした細胞では、１細胞あたりのエクソソームの分泌量が増加していることが明らかとなった。さらに単離した分泌膜小胞をCD63抗体を用いた免疫電子顕微鏡法による観察を行い、エクソソームマーカー蛋白を発現していることを確認した。
次に、上記の方法で回収したエクソソームサンプルをLC/MS法により解析し、細胞老化の誘導前後でエクソソームに含まれる蛋白成分がどのように変化するのかを明らかにした。
また、mirVana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystem社)を用いてエクソソームRNAを調整し、qRT-PCR法によって細胞老化特異的に分泌量が増加しているエクソソームRNAを明らかにした。
このように、初年度の研究により細胞老化をおこした細胞ではエクソソームの分泌量が増加していること、またエクソソームに含まれる蛋白やRNAのプロファイルが変化していることが明らかとなった。
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