| 研究課題/領域番号 |
25290053
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| 研究機関 | 愛知県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
関戸 好孝 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学部, 副所長兼部長 (00311712)
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| 研究分担者 |
村上 優子(渡並優子) 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学部, 主任研究員 (70405174)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 癌 / 腫瘍抑制遺伝子 / ゲノム / 悪性中皮腫 / 合成致死 |
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| 研究実績の概要 |
腫瘍抑制遺伝子BAP1は悪性中皮腫症例の約25％に不活性化変異が検出される。BAP1の機能はヒストン修飾による標的遺伝子の転写制御やDNA損傷の修復時のおける役割が想定されているが、中皮腫におけるBAP1機能の実態は未だ明らかではない。本年度は中皮腫細胞株を用い、BAP1と合成致死の表現型を見いだすための実験を進めた。細胞株はBAP1変異中皮腫細胞株H28に野生型BAP1を過剰発現した細胞株及びコントロール株としてH28にVenusを過剰発現した細胞株を用いた。
ゲノムワイドなレンチウイルスshRNAライブラリーをBAP1過剰発現細胞株およびコントロール細胞株に感染させ、一次スクリーニングを行った。培養後、両細胞株よりゲノムDNAを抽出し、ゲノムにインテグレイトされたshRNAの配列を次世代シークエンサー解析により同定した。コントロール細胞株ではshRNAが存在するものの、BAP1過剰発現細胞株では存在しない遺伝子群の抽出を試みた。実験はtriplicateで行い、現在抽出された遺伝子群の解析を進めている。
一方、BAP1やNF2（中皮腫の約50％で不活性化変異）との合成致死を生じる可能性のある分子についてin silicoの検討によって抽出された分子に対して特異的阻害剤による検討を行った。その中でピルビン酸リン酸化酵素M2（PKM2）に対する阻害剤シコニンが、NF2遺伝子変異を有する2株に対して増殖抑制効果を有する一方、NF2が野生型である株では増殖抑制効果がみられないことから、NF2変異とPKM2の発現低下が合成致死表現型を示す可能性が示唆された。シコニンの標的分子PKM2に対するshRNAを用いても同様の増殖抑制効果が確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画は3年間の計画であり、平成26年度はその中間であるがおおむね順調に進行していると考えられる。悪性中皮腫の原因遺伝子として現在、最も注目を集めているBAP1、NF2およびLATS2腫瘍抑制遺伝子に焦点を定め研究を継続した。第一にレンチウイルスshRNAライブラリーをBAP1変異中皮腫細胞株、NF2変異中皮腫細胞株、LATS2変異中皮腫細胞株及びそれぞれのコントロール細胞株に感染させ、一次スクリーニングを開始することができた。既に、次世代シークエンサーによるshRNAの同定を行っており、合成致死を引き起こす遺伝子候補が抽出されつつある。第二にBAP1やNF2と合成致死を示す可能性のある候補分子・パスウェイをWeb上で公開されている悪性中皮腫患者の発現データ・予後データを用いたin silicoによる解析（バイオインフォマティクスなど、コンピューターを用いた解析）によって抽出し、それらの分子に対する各種阻害剤の検討を開始することができた。その中で、NF2遺伝子変異を有する２細胞株でピルビン酸リン酸化酵素M2に対する阻害薬が増殖抑制能を有することが示唆されたのは極めて興味深いことと考えられ、現在、合成致死を起こす分子機構について詳しく検討を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、行っている一次スクリーニングを重ねて遂行し、Triplicateで行った実験で共通して増殖抑制を引き起こすと考えられる遺伝子群を抽出する。BAP1、NF2、LATS2と合成致死を示す候補遺伝子は数百単位でピックアップされてくることが予想されるので、Web上で公開されている悪性中皮腫患者の発現データ・予後データとの整合性、遺伝子群に対してパスウェイ解析等で同じパスウェイに属する遺伝子を選別する等、分類･順位付けを行っていく。分類･順位付けを行った候補遺伝子に対して二次スクリーニングを行い、さらに絞り込んでいくととともに、抽出された遺伝子に対して個別に複数個のshRNAによるノックダウンを行い、合成致死が誘導されるかどうか検討する。また候補遺伝子について、合成致死を起こす分子機構について検討を進める。候補遺伝子について、予後のマーカーになるか、また、既に阻害剤の存在するものであれば、阻害剤を用いても同様の効果を起こすか検討し、時間的な余裕があればマウスモデルなどを用いて検討をすすめる。
合成致死を示す遺伝子に関して、中皮腫の新規診断法・治療法への応用の可能性についても検討を加え、得られた結果をとりまとめて成果発表を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
shRNAスクリーニングを開始したが、その実験が若干遅れたため、引き続き必要とされる実験に関する消耗品の購入をする必要がなくなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
sHRNAスクリーニングが順調に行うことができたため、予定されていた試薬・プラスチック器具等を購入する予定である。
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