| 研究課題/領域番号 |
25290067
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 甲南大学 |
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研究代表者 |
日下部 岳広 甲南大学, 理工学部, 教授 (40280862)
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| 研究分担者 |
中井 謙太 東京大学, 医科学研究所, 教授 (60217643)
鈴木 穣 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ホヤ / メダカ / 転写調節 / 神経系 / 発生・分化 |
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| 研究概要 |
カタユウレイボヤ諸器官および各発生段階から得たRNAを用いて、大量の5' 端EST配列を次世代型超並列シークエンサーで決定し、ゲノムへのマッピングを行った。マッピング結果からは、転写開始点の情報に加え、新規な組織特異的および発生段階特異的遺伝子発現に関する情報が得られた。細胞の個性獲得に関わることが実験的に示された転写因子にタグをつけた融合タンパク質を、ホヤ胚において過剰発現させ、タグ配列に対する抗体を用いて、クロマチン免疫沈降を行った。メダカの網膜視細胞で特異的に発現する遺伝子群について、転写制御領域を比較ゲノム解析と保存モチーフ検索を行い、シス調節配列および転写制御因子を推定した。その過程で視細胞サブタイプ特異的な遺伝子発現制御に関わる因子として２種類のマイクロRNAを同定し、これらが標的とするmRNAを推測した。これらのマイクロRNAは染色体上で隣接し同じ視細胞で発現するオプシン遺伝子とシス制御モジュールを共有する双方向プロモーターから転写されることを示し、共有シス制御モジュールに結合する転写調節因子の候補をみいだした。神経系における新たな細胞分化制御因子として、生殖幹細胞に必要な因子として知られるPiwiタンパク質をみいだした。これらの制御因子の機能解析法として、これまで主に行ってきたアンチセンス・モルフォリノオリゴを用いた遺伝子ノックダウンに加え、CRISPR-Cas9システムを用いた遺伝子ノックアウトによる解析に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
染色体上の遺伝子配置、転写制御、マイクロRNAによる転写後制御により構成される遺伝子制御ネットワークの発見や新たな制御因子の同定など、重要な新知見を得ることができた点、およびCRISPR-Cas9法によるゲノム編集が軌道に乗りつつある点で、予定通りまたはそれ以上に順調に進展していると評価できる。一方、ChIP-Seqに関して、外来遺伝子としてタグを付加した転写因子を導入する方法では大量の試料の調製に難があり、計画よりも遅れている。胚がもつ内在性の転写因子を認識する抗体を作製しており、これらを利用することで問題を克服できると期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は以下の項目を中心に研究を推進する予定である。
１．ゲノムワイドな転写開始点のマッピング：ホヤについてはほぼ完了したので、メダカの脳・脊髄と網膜について解析を行う。
２．ChIP-Seq法によるゲノム中の転写因子結合部位の同定：これまで行ってきた転写因子にタグをつけた融合タンパク質を胚に過剰発現させ、タグ配列に対する抗体を用いる方法に加え、内在性の転写因子を認識する抗体を新たに作製して用いる。
３．細胞の個性獲得制御に関わる細胞間シグナル、小分子RNA、転写因子の機能解析：ノックダウン実験に加え、CRISPR-Cas9法によるノックアウト、薬剤による機能阻害、野生型および変異体の強制発現などの実験を行い、表現型を解析する。新規制御因子の候補として同定したマイクロRNAやPiwiの機能解析、CRISPR-Cas9法によるノックアウト実験に特に力点をおく。
４．標的遺伝子の推定と実験検証：(1) ChIP-Seq解析により転写因子が結合していることが示されたDNA領域と転写開始点の情報をもとに、標的候補遺伝子を推測、ノックダウン、ノックアウト、または過剰発現胚における候補遺伝子発現を調べることにより検証する。(2) ChIP-Seqで解析対象とした転写因子の結合コンセンサス配列を解析すると共に、協調して作用する転写因子群を推測する。(3) 蛍光レポーターに連結したプラスミドコンストラク卜を構築し、胚に導入して発現を調べることで、転写調節領域の機能解析・シス配列候補の実験による検証を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
クロマチン免疫沈降解析および分化制御因子の生化学的な解析に用いるため抗体を複数の因子に対して作製する予定であったが、２５年度中は抗原部位の選定および抗原を発現するためのプラスミドコンストラクトの設計にとどまったため、本来２５年度中に執行予定であった抗体作製のために必要な費用を次年度に繰り越すことになったため。
上記で述べた抗体作製のための抗原発現コンストラクトの設計、抗原タンパク質調製、抗体作製のための費用（研究員の雇用を含む）に使用する。また、実験に用いる動物個体の購入、運搬、採集、飼育に要する費用を支出する。さらに、研究成果発表および研究打合せのための旅費、遺伝子機能解析のための試薬の購入と配列解析のための費用を支出する。
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