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2013 年度 実績報告書

化学修飾ペプチド核酸によるウイルスゲノム1塩基変異の高感度診断法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 25290073
研究種目

基盤研究(B)

研究機関大阪大学

研究代表者

開發 邦宏  大阪大学, 産業科学研究所, 特任准教授(常勤) (70419464)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード核酸塩基 / 塩基配列識別 / ペプチド核酸
研究概要

A型インフルエンザウイルスH1型のタミフル耐性は、同ウイルスの酵素“ノイラミニダーゼ”の触媒活性部位に位置する274番目ヒスチジンがチロシンに変異することが主要因である。現在、このノイラミニダーゼの変異を抗体で検出する技術はない。一方、このアミノ酸変異はノイラミニダーゼをコードするゲノムの1塩基変異(G→A)によるものであり、PCRとゲノム配列解析などにより診断することは可能である。しかしながら、感染症の診断現場においては遺伝子解析により患者が罹患したウイルスがタミフル耐性かどうかを遺伝子診断することは現実的ではない。そこで、ウイルスゲノムの一塩基変異を核酸間の室温条件における結合の有無で迅速に識別する新規核酸分子の創製を目指した。
本年度は、タミフル耐性ウイルスに対して完全相補配列を有するペプチド核酸(anti-OPR PNA; anti-oseltamivir phosphate-resisitant PNA)を合成し、タミフル耐性ウイルスゲノム配列、および感受性ウイルスのゲノム識別能を評価した。
その結果、ペプチド核酸のチミン塩基の代わりに、チオウラシルを用い、さらにそのチオウラシルの6位にプロピル基を導入すると、ミスマッチ配列に対する結合能が大幅に減少することが明らかになった。Anti-OPR PNAのタミフル耐性配列に対する会合体の安定性と、その1塩基ミスマッチ配列であるタミフル感受性配列に対する安定性の差が天然核酸では約7℃しかなかったのに対して、約20℃に広がることが明らかとなった。
以上のことから、ピリミジン塩基の6位という、核酸間の塩基対形成に関与しない部分の置換基が対面の核酸塩基の相補性に従い、相補鎖との安定性に影響するという興味深い結果が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成25年度では、ペプチド核酸(PNA)のチミン塩基を2-チオウラシルとし、さらにその6位に化学修飾を施した新規核酸分子の合成に成功した。次に、タミフル耐性ウイルスのノイラミニダーゼをコードするゲノム配列に相補的なオリゴマーのチミンの代わりに導入した。そして、完全相補的なタミフル耐性ウイルスゲノム配列、又は、一塩基ミスマッチ配列を含むタミフル感受性ウイルスゲノム配列を含むDNAに対して作用させた。その結果、新規核酸塩基を含むPNAは、タミフル耐性配列に選択的に結合し、当初の目標であった、一塩基変異配列との会合体形成能を約7℃から約20℃まで拡大することに成功した。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると評価した。

今後の研究の推進方策

核酸塩基のうち、ピリミジンの6位置換基は、非相補鎖に対する安定性を低下させることが明らかとなった。その一般性を確認するとともに、ピリミジンの5位にも種々の置換基を導入して、その配列選択性に及ぼす影響を検証するとともに、さらに相補鎖識別能の高い分子の創製を目指す。また、インターカレーター分子なども化学修飾し、一塩基変異配列をさらに効果的に識別することを目指す。

次年度の研究費の使用計画

2014年3月中に技術補佐員による研究補助業務を委託する予定であったが、候補者の家族の転勤が急遽決まり、技術補佐の雇用ができなくなり、他の候補者を探すことが必要となったため。
技術補佐員の雇用開始が当初計画より1か月遅れた分、雇用修了時期も1か月ずらすことで適切に研究費の使用計画を実施する予定である。

  • 研究成果

    (12件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (9件) (うち招待講演 3件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Rapid idenfitication of swine-origin influenza A virus by peptide nucleic acid-chromatography2013

    • 著者名/発表者名
      K. Kaihatsu, S. Sawada, N. Kato
    • 雑誌名

      Journal of Antivirals & Antiretrovirals

      巻: 4 ページ: 77-79

    • DOI

      10.4172/jaa.1000067

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Sequence-specific and visual identification of influenza virus gene by azobenzene-tethered   bis-peptide nucleic acid2013

    • 著者名/発表者名
      K. Kaihatsu, S. Sawada, S. Nakamura, T. Nakaya, T. Yasunaga, N. Kato
    • 雑誌名

      PLoS ONE

      巻: 8 ページ: e64017(1-5)

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0064017

    • 査読あり
  • [学会発表] インターカレーター修飾ペプチド核酸によるDNA 一塩基識別2014

    • 著者名/発表者名
      岡崎実来、早矢仕恬子、澤田慎二郎、開發邦宏、加藤修雄
    • 学会等名
      日本化学会第94回春季年会
    • 発表場所
      名古屋大学
    • 年月日
      20140327-20140330
  • [学会発表] 非天然ピリミジン塩基を有するペプチド核酸の相補鎖会合特性2014

    • 著者名/発表者名
      高木賢至、周怡亭、開發邦宏、加藤修雄
    • 学会等名
      日本化学会第94回春季年会
    • 発表場所
      名古屋大学
    • 年月日
      20140327-20140330
  • [学会発表] Identification of Influenza Virus by Anti-Viral Gene Peptide Nucleic Acid2014

    • 著者名/発表者名
      Kunihiro Kaihatsu, Nobuo Kato
    • 学会等名
      The 17th Sanken International Symposium, The 2nd International Symposium of Nano-Macro Materials, Device, and System Research Alliance Project
    • 発表場所
      大阪大学
    • 年月日
      20140121-20140122
    • 招待講演
  • [学会発表] Recognition of Single Base Mismatch within Single Strand DNA by Intercalator-Modified Peptide Nucleic Acid2014

    • 著者名/発表者名
      Miku Okazaki, Tenko Hayashi, Shinjiro Sawada, Kunihiro Kaihatsu, Nobuo Kato
    • 学会等名
      The 17th Sanken International Symposium, The 2nd International Symposium of Nano-Macro Materials, Device, and System Research Alliance Project
    • 発表場所
      大阪大学
    • 年月日
      20140121-20140122
  • [学会発表] Effect of 5, 6-substituted pyrimidine bases on peptide nucleic acid duplex formation stability2014

    • 著者名/発表者名
      Kenji Takagi, Yiting Zhou, Kunihiro Kaihatsu, Nobuo Kato
    • 学会等名
      The 17th Sanken International Symposium, The 2nd International Symposium of Nano-Macro Materials, Device, and System Research Alliance Project
    • 発表場所
      大阪大学
    • 年月日
      20140121-20140122
  • [学会発表] ゲノム一塩基変異を識別する非天然核酸分子の創製2013

    • 著者名/発表者名
      開發邦宏
    • 学会等名
      第10回バイオオプティクス研究会
    • 発表場所
      東京農工大
    • 年月日
      20131206-20131207
    • 招待講演
  • [学会発表] Sequence-specific detection of a single base pair mismatches by tolane-modified peptide nucleic acid2013

    • 著者名/発表者名
      Miku Okazaki, Tenko Hayashi, Shinjiro Sawada, Kunihiro Kaihatsu, Nobuo Kato
    • 学会等名
      The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
    • 発表場所
      Kanagawa University
    • 年月日
      20131113-20131115
  • [学会発表] Effect of pseudo-pyrimidine bases on peptide nucleic acid duplex formation stability2013

    • 著者名/発表者名
      Kenji Takagi, Yiting Zhou, Kunihiro Kaihatsu, Nobuo Kato
    • 学会等名
      The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
    • 発表場所
      Kanagawa University
    • 年月日
      20131113-20131115
  • [学会発表] Diagnosis of influenza A/H1N1pdm virus genome by hairpin-type peptide nucleic acid chromatography2013

    • 著者名/発表者名
      Kunihiro Kaihatsu
    • 学会等名
      Option for the control of Influenza VIII
    • 発表場所
      Capetown, South Africa
    • 年月日
      20130904-20130911
    • 招待講演
  • [図書] ペプチド核酸を利用したインフルエンザウイルスのゲノム診断法2013

    • 著者名/発表者名
      開發邦宏、加藤修雄
    • 総ページ数
      5
    • 出版者
      化学工業

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公開日: 2015-05-28  

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