| 研究課題/領域番号 |
25291003
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
剣持 直哉 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (00133124)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | リボソーム / 疾患モデル / 翻訳 / ダイヤモンド・ブラックファン貧血 / 造血異常 / 発がん / 核小体 / ゼブラフィッシュ |
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| 研究概要 |
選択的なmRNAの翻訳を制御するリボソームCODEを解読し、その破綻が引き起こすリボソーム病の発症機構を明らかにするために、本年度は、ゼブラフィッシュを用いてダイヤモンド・ブラックファン貧血（DBA）モデルの解析および発がんモデルの作製・解析を行った。
1. DBAモデルおよび野生型のゼブラフィッシュ胚からショ糖密度勾配遠心法によりポリソーム画分を調製し、ここから抽出したmRNAをDNAチップおよび次世代シーケンサーを用いて比較した。その結果、リボソームタンパク質RPS19の欠損により翻訳が変動したと考えられる遺伝子300個を同定した。これらの遺伝子のパスウェイ解析を行った結果、DBA発症に重要と思われる遺伝子を２つ絞り込んだ。現在、この遺伝子の過剰発現およびノックダウンを行い、疾患発症との関連を検討している。なお、次世代シーケンサーによる解析は、連携研究者の鈴木穣（東京大学）が担当した。
2. RP遺伝子の異常に起因した腫瘍形成の分子機構を明らかにするために、Tol2のシステムを用いて、肝臓、神経、体節に特異的なプロモーターを有するmiRNA遺伝子（RPS8aを標的とする）をゼブラフィッシュのゲノムに組み込んだ。これらのゼブラフィッシュを長期に飼育・観察を行った結果、神経特異的なプロモーターを持つゼブラフィッシュで腫瘍の形成を確認した（発がんモデル）。この個体から組織切片を作製し、現在、組織化学的な手法で、特異性およびRPS8aの発現レベルなどの解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、DBAモデルの解析、発がんモデルの作製・解析に取り組んだ。DBAモデルの解析については、すでに候補遺伝子を絞り込み、現在その検証を行っている。miRNA遺伝子を組み込んだゼブラフィッシュに関しては、ようやく腫瘍の形成が確認できたことから、発がんモデルとして現在その解析を進めている。以上のことより、研究は順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、DBAモデルに関しては、絞り込んだ遺伝子の解析を進め疾患発症との関連を明らかにする。発がんモデルに関しては、がん細胞の由来を決定するとともにRPS8aの発現レベルの解析を行う。また、平成26年度から開始する実験として、新たなDBAモデルを作製するために、CRISPR/Casシステムを用いてRPS19遺伝子にヘテロ変異を持つゼブラフィッシュを作製する。さらに、RNA修飾の役割を解析するために、すでに作製してあるRNA修飾欠損モデルのポリソーム解析を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
関連した研究をすでに開始していたため試薬などの初期費用が抑制され、当初見込額との差額が生じた。
物品費は、一般的な試薬・器具の他、ゼブラフィッシュの飼育費用などに使用する。旅費は、コールドスプリングハーバー（米国）での国際会議、RNA学会（名古屋）など国内の関連学会へ参加するために使用する。人件費は、研究員およびゼブラフィッシュの飼育・管理を担当する実験補助員の雇用のために使用する。その他の経費は、論文発表するための投稿料、学会の参加費などに使用する。
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