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2014 年度 実績報告書

リボソームCODEの破綻とリボソーム病発症の分子機構

研究課題

研究課題/領域番号 25291003
研究機関宮崎大学

研究代表者

剣持 直哉  宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (00133124)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワードリボソーム / 疾患モデル / 翻訳 / ダイヤモンド・ブラックファン貧血 / 造血異常 / 発がん / 核小体 / ゼブラフィッシュ
研究実績の概要

mRNAの選択的翻訳を制御する「リボソームCODE」の存在を明らかにし、その破綻が引き起こすリボソーム病の発症機構を明らかにするために以下の解析を行った。
1. DBAモデルにおいて翻訳効率が変動した遺伝子の解析:ゼブラフィッシュDBAモデルのポリソームmRNA解析およびトランスクリプトーム解析により翻訳効率が大きく変動した遺伝子のうち、造血に関与する遺伝子およびエクソーム解析で変異が同定された遺伝子の計8種類に着目して疾患発症との関連について解析した。mRNAの注入による遺伝子の過剰発現、アンチセンスオリゴを用いたノックダウン実験を行った結果、現時点で2つの遺伝子がDBA発症に関与している可能性が明らかとなった。
2. RNA修飾の解析:rRNAの修飾が欠損したゼブラフィッシュモデルおよび修飾酵素(ディスケリン)を欠損した先天性角化不全症(DC)モデルを作製し、ポリソームのmRNA解析およびDNAチップを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、翻訳効率が大きく変動している遺伝子を複数同定した。
3. ゲノム編集技術を用いたDBAモデルの作製:CRISPR/Casシステムを用いてRPS19遺伝子に変異を持つゼブラフィッシュの作製を試みた。CRISPR/Casを導入したゼブラフィッシュ胚は異常な表現型を示し、約90%は致死となった。RPS19の変異をPCRで解析した結果、多くの胚で部分欠失が認められた。現在、F1世代を解析するためにマイルドな表現型を示した胚の飼育を継続中である。
4. 新たなDBA遺伝子の同定:エクソーム解析で新たに変異が同定された2つのRP遺伝子(RPS27, RPL27)の機能解析をゼブラフィッシュで行った。ノックダウン胚ではDBA患者と同様に赤血球の減少が認められた。また、正常なmRNAの注入による造血の回復も確認されたことから、これらの遺伝子を新たなDBA遺伝子として報告した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

疾患モデルを用いたmRNAの翻訳効率の解析は順調に進展しており、新たな候補遺伝子も含めて8個の遺伝子の解析が進んでいる。さらに、患者エクソームの解析データにアクセスできたことから、これらの情報と併せることでより確実性の高い解析が可能となった。また、エクソームデータが新たなDBA遺伝子の同定につながったことは、当初の予定を上回る成果である。さらに、RNA修飾の解析、CRISPR/Casシステムを用いたRPS19変異体の作製も、ほぼ予定通りに進んでいる。以上のことから、研究は全体として「おおむねね順調に進展している」と考えられる。

今後の研究の推進方策

翻訳効率が変動した8個の遺伝子全ての解析を完了する。また、エクソーム解析で同定されたその他のDBA候補遺伝子の解析を進める。さらに、ゲノム編集技術によるゼブラフィッシュ変異体(リボソーム病モデル)の確立を目指す。

次年度使用額が生じた理由

他のプロジェクトで類似の研究を行っていたため、消耗品や魚の飼育費などの経費が抑制され、当初見込額との間に差額が生じた。

次年度使用額の使用計画

物品費は、一般的な試薬・器具の他、ゼブラフィッシュの飼育費などに使用する。旅費は、国際リボソームミーティング(ベルギー)および分子生物学会など関連学会への参加・発表のための経費として使用する。人件費・謝金は、研究を効率的に推進するために研究員および実験補助員を雇用する経費として使用する。その他の経費は、論文発表するための投稿料、学会の参加料などに使用する。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 1件) 備考 (4件)

  • [雑誌論文] Incomplete splicing of neutrophil-specific genes affects neutrophil development in a zebrafish model of poikiloderma with neutropenia2015

    • 著者名/発表者名
      Patil, P., Uechi, T. Kenmochi, N.
    • 雑誌名

      RNA Biology

      巻: 12 ページ: 426-434

    • DOI

      10.1080/15476286.2015.1017240

    • 査読あり
  • [雑誌論文] scaRNAs regulate splicing and vertebrate heart development2015

    • 著者名/発表者名
      Patil P, Kibiryeva N, Uechi T, Marshall J, Artman M, O'Brien JE, Kenmochi N, Bittel, DC
    • 雑誌名

      Biochem. Biophys. Acta (in press)

      巻: 0 ページ: 0

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Loss of function mutations in RPL27 and RPS27 identified by whole-exome sequencing in Diamond-Blackfan anaemia2015

    • 著者名/発表者名
      Wang R, Yoshida K, Toki T, Sawada T, Uechi T,...Kenmochi N, Ogawa S, Ito E
    • 雑誌名

      Br. J. Haematol.

      巻: 168(6) ページ: 858-864

    • DOI

      10.1111/bjh.13229

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Ribosomal protein deficiency causes Tp53-independent erythropoiesis failure in zebrafish2014

    • 著者名/発表者名
      Yadav VG, Chakraborty A, Uechi T, Kenmochi N
    • 雑誌名

      Int. J. Biochem. Cell Biol.

      巻: 49 ページ: 1-7

    • DOI

      10.1016/j.biocel.2014.01.006

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] ゼブラフィッシュを用いたリボソーム病発症機構の解明2015

    • 著者名/発表者名
      上地珠代, 中島由香里, グナネッシュワ ヤダフ, 吉浜麻生, 鈴木穣, 菅野純夫, 剣持直哉
    • 学会等名
      第3回リボソームミーティング
    • 発表場所
      宮崎
    • 年月日
      2015-03-17 – 2015-03-18
  • [学会発表] Ribosomal Dysfunction and Defective Erythropoiesis in a Zebrafish Model of Diamond-Blackfan Anemia2015

    • 著者名/発表者名
      Tamayo Uechi, Yukari Nakajima, Gnaneshwar Yadav, Maki Yoshihama, Yutaka Suzuki, Sumio Sugano, and Naoya Kenmochi
    • 学会等名
      Translation Machinery in Health & Disease (Gordon Research Conferences)
    • 発表場所
      Ventura, USA
    • 年月日
      2015-02-22 – 2015-02-27
  • [学会発表] ゼブラフィッシュ初期発生におけるRNA修飾の役割2014

    • 著者名/発表者名
      剣持直哉
    • 学会等名
      第37回分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
    • 招待講演
  • [学会発表] 選択的な翻訳制御と疾患:ゼブラフィッシュを用いたリボソーム病発症機構の解明2014

    • 著者名/発表者名
      上地珠代, 中島由香里, Gnaneshwar Yadav, 吉浜麻生, 鈴木穣, 菅野純夫, 剣持直哉
    • 学会等名
      第37回分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] Defects in ribosomal proteins cause erythroid failure in a zebrafish model of Diamond-Blackfan anemia2014

    • 著者名/発表者名
      Tamayo Uechi, Yukari Nakajima, Gnaneshwar Yadav, Maki Yoshihama, Yutaka Suzuki, Sumio Sugano, and Naoya Kenmochi
    • 学会等名
      第20回小型魚類研究会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2014-09-20 – 2014-09-21
  • [学会発表] Studying the molecular pathogenesis of Diamond-Blackfan anemia using zebrafish as a model system2014

    • 著者名/発表者名
      Tamayo Uechi, Yukari Nakajima, Gnaneshwar Yadav, Maki Yoshihama, Yutaka Suzuki, Sumio Sugano, and Naoya Kenmochi
    • 学会等名
      The 14th Conference on Translational Control
    • 発表場所
      Cold Spring Harbor, USA
    • 年月日
      2014-09-02 – 2014-09-06
  • [学会発表] RPG and snOPY: Databases for ribosomal protein genes and small nucleolar RNA genes2014

    • 著者名/発表者名
      Maki Yoshihama, Akihiro Nakao, Shusaku Kamada, Naoya Kenmochi
    • 学会等名
      The 19th Annual Meeting of the RNA Society
    • 発表場所
      Quebec, Canada
    • 年月日
      2014-06-03 – 2014-06-08
  • [学会発表] Ribosome dysfunction and erythroid failure: Analyzing the zebrafish model of Diamond-Blackfan anemia2014

    • 著者名/発表者名
      Tamayo Uechi, Yukari Nakajima, Gnaneshwar Yadav, Yutaka Suzuki, Sumio Sugano, and Naoya Kenmochi
    • 学会等名
      The 19th Annual Meeting of the RNA Society
    • 発表場所
      Quebec, Canada
    • 年月日
      2014-06-03 – 2014-06-08
  • [備考] snoRNA遺伝子データベース

    • URL

      http://snoopy.med.miyazaki-u.ac.jp/

  • [備考] 剣持研究室ホームページ

    • URL

      http://ribosome.med.miyazaki-u.ac.jp/labo/

  • [備考] リボソームタンパク質遺伝子データベース

    • URL

      http://ribosome.med.miyazaki-u.ac.jp/

  • [備考] ゼブラフィッシュRP遺伝子ノックダウンデータベース

    • URL

      http://zebrafish.med.miyazaki-u.ac.jp/

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公開日: 2016-06-01  

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