多剤排出輸送体の構造生物学

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25291011
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 石谷 隆一郎 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90361568)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: Ｘ線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 多剤耐性菌 / 薬物動態

研究実績の概要

DMT (Drug-Metabolite Transporter) ファミリー輸送体に関して，多数の細菌ゲノム情報に基づき発現コンストラクトをGFP蛋白質との融合体として作成した．さらに，大腸菌を用いた小スケールの発現系で発現条件の検討を行った．そして，大腸菌の膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，粗抽出状態でGFPの蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィーを行った．その結果，２種の系で単分散性が高い構造解析に適した系を見出すに至った．さらに，これらの系について数リットルの培地を用いた大量培養を行い，膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，Hisタグを用いたNiアフィニティークロマトグラフィーによる精製，プロテアーゼによるGFPの切断，ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行った結果，高純度でDMT輸送体タンパク質の精製標品を得ることに成功した．現在結晶化スクリーニングを行っている．真核生物由来MATEに関しても，多数の真核生物のゲノム情報に基づき発現コンストラクトをGFP蛋白質との融合体として作成した．さらに，ヒト培養細胞を用いた小スケールの発現系で発現条件の検討を行った．そして，膜画分を調製，界面活性剤で可溶化後，粗抽出状態でGFPの蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィーを行った．その結果，２種の系で単分散性が高い構造解析に適した系を見出すに至った．現在，大量調製と生成，結晶化を行うべく構造解析を推進している．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

細菌由来DMTとMATEに関しては予定通り計画が進んでおり，今後構造決定と輸送メカニズム解明を目指し，論文投稿へと進める．真核生物由来MATEに関しては，構造解析可能なレベルの量・純度・安定性を有する真核生物由来MATE 発現系の網羅的探索を進行中であり，予定通り計画が進んでいる．

今後の研究の推進方策

細菌由来MATEに関しては，外向き開状態の構造決定には至ったが，今後は論文執筆を進める．またDMTに関してはその機能解析と構造決定に集中する．真核生物由来に関しては，今後構造解析可能な系の探索を進め構造決定を目指す．

研究成果

• [雑誌論文] Structural basis for the facilitative diffusion mechanism by SemiSWEET transporter (2015)
  • 著者名/発表者名: Lee Y, Nishizawa T, Yamashita K, Ishitani R, Nureki O
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 6 ページ: 6112
  • DOI: doi: 10.1038/ncomms7112
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki K, Kishimoto T, Furukawa A, Mori H, Tanaka Y, Dohmae N, Ishitani R, Tsukazaki T, Nureki O
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 4 ページ: 7299
  • DOI: doi: 10.1038/srep07299
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural basis for ion selectivity revealed by high-resolution crystal structure of Mg(2+) channel MgtE (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Hattori M, Nishizawa T, Yamashita K, Shah ST, Caffrey M, Maturana AD, Ishitani R, Nureki O
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 5 ページ: 5374
  • DOI: doi: 10.1038/ncomms6374
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The non-canonical hydroxylase structure of YfcM reveals a metal ion-coordination motif required for EF-P hydroxylation (2014)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi K, Katz A, Rajkovic A, Ishii R, Branson OE, Freitas MA, Ishitani R, Ibba M, Nureki O
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: 42 ページ: 12295-12305
  • DOI: doi: 10.1093/nar/gku898
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of YfcM: an important factor for EF-P hydroxylation (2014)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi K, Suzuki T, Dohmae N, Ishitani R, Nureki O
  • 雑誌名: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 巻: 70 ページ: 1236-1239
  • DOI: doi: 10.1107/S2053230X14015726
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki K, Tsukazaki T, Nishizawa T, Tanaka Y, Kato HE, Nakada-Nakura Y, Hirata K, Mori Y, Suga H, Dohmae N, Ishitani R, Nureki O
  • 雑誌名: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 巻: 70 ページ: 1056-1060
  • DOI: doi: 10.1107/S2053230X14012540
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structure of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial Qri7 in complex with AMP (2014)
  • 著者名/発表者名: Tominaga T, Kobayashi K, Ishii R, Ishitani R, Nureki O
  • 雑誌名: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 巻: 70 ページ: 1009-1014
  • DOI: doi: 10.1107/S2053230X14014046
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Enpp6 (2014)
  • 著者名/発表者名: Morita J, Kato K, Mihara E, Ishitani R, Takagi J, Nishimasu H, Aoki J, Nureki O
  • 雑誌名: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 巻: 70 ページ: 794-799
  • DOI: doi: 10.1107/S2053230X14008929
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure of a claudin provides insight into the architecture of tight junctions (2014)
  • 著者名/発表者名: Suzuki H, Nishizawa T, Tani K, Yamazaki Y, Tamura A, Ishitani R, Dohmae N, Tsukita S, Nureki O, Fujiyoshi Y
  • 雑誌名: Science 巻: 344 ページ: 304-307
  • DOI: doi: 10.1126/science.1248571
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki K, Chiba S, Takemoto M, Furukawa A, Nishiyama K, Sugano Y, Mori T, Dohmae N, Hirata K, Nakada-Nakura Y, Maturana AD, Tanaka Y, Mori H, Sugita Y, Arisaka F, Ito K, Ishitani R, Tsukazaki T, Nureki O
  • 雑誌名: Nature 巻: 509 ページ: 516-520
  • DOI: doi: 10.1038/nature13167
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial GatFAB reveals a novel subunit assembly in tRNA-dependent amidotransferases (2014)
  • 著者名/発表者名: Araiso Y, Huot JL, Sekiguchi T, Frechin M, Fischer F, Enkler L, Senger B, Ishitani R, Becker HD, Nureki O
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: 42 ページ: 6052-6063
  • DOI: doi: 10.1093/nar/gku234
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 先端放射光を用いたチャネル・トランスポーターの高分解能構造解析と分子機構の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 石谷隆一郎
  • 学会等名: 日本放射光学会
  • 発表場所: 立命館大学びわこ･くさつキャンパス
  • 年月日: 2015-01-11 – 2015-01-11
  • 招待講演
• [学会発表] 炎症応答に関わる因子とその機能をモデュレートする化合物の構造生物学 ― Cyclic GMP-AMP合成酵素の結晶構造 ― (2014)
  • 著者名/発表者名: 石谷隆一郎
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜会議センター
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-25
  • 招待講演
• [学会発表] 炎症応答に関わる因子の構造生物学 Cyclic GMP-AMP合成酵素の結晶構造 (2014)
  • 著者名/発表者名: 石谷隆一郎
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館
  • 年月日: 2014-10-16 – 2014-10-16
  • 招待講演
• [学会発表] Crystal structure of channelrhodopsin ― a light-gated cation channel ― (2014)
  • 著者名/発表者名: 石谷隆一郎
  • 学会等名: 16th International Congress on Photobiology
  • 発表場所: Universidad Nacional de Cordoba, Cordoba, Argentina
  • 年月日: 2014-09-08 – 2014-09-08
  • 招待講演