| 研究課題/領域番号 |
25291015
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
永野 真吾 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60286440)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アナモックス / 水質浄化 / ヘム / 蛋白質 / 結晶構造 / 窒素循環 |
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| 研究概要 |
汚水の浄化には窒素化合物の除去が必須であり、現行の方法では、窒素化合物を除去する微生物の生育のために有機物を投入し、動力を使って空気を送り込む等、大きなエネルギーを消費している。しかし近年発見された嫌気性かつ独立栄養性のアナモックス菌によって窒素除去を行うと、これらの処置がほとんど不要となり水質浄化の大幅な省エネルギー化が実現できる。この水質浄化の鍵を握るのが、アナモックス菌特有の窒素除去反応である。本研究ではこの反応に最も重要なヒドラジン合成酵素に注目し、それらのX線結晶構造解析などから、アナモックス菌による次世代省エネルギー水質浄化法と窒素化合物代謝の分子基盤を解明する。
本年度はアナモックス菌による窒素除去反応の鍵となるヒドラジン合成酵素の結晶構造解析を進めるため、すでに培養に成功しているアナモックス菌の培養システムを活用し、大量培養を行った。また、このアナモックス菌からヒドラジン合成酵素 (HZS) 遺伝子クラスターをクローニングし、大腸菌を用いた発現系の構築を進めた。HZSはヘテロ3量体であるので、まず各サブユニット (A, B, Cサブユニット)の単独での発現を試み、A, Cサブユニットの発現を確認できた。しかし活性部位をもつBサブユニットの発現は確認されず、Aサブユニットにおいて電子伝達を担うと考えられるヘムｃの挿入も確認されなかった。そこですべてのサブユニットの発現系を新たに構築した。この発現系でヘムｃが挿入されたA,Bサブユニットの発現が確認された。来年度はHZSの結晶化を目指し、酵素活性の確認と発現条件の最適化を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初計画していた常温で生育するアナモックス菌の大量培養とヒドラジン合成酵素(HZS)の発現系構築に成功している。さらに、平成26年度に予定していた好熱性のアナモックス菌からHZSをクローニングし、発現系を構築することにも成功しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度に常温で生育するアナモックス菌および菱刈金山熱水由来のアナモックス金からヒドラジン合成酵素(HZS)の遺伝子をクローニングし、大腸菌をもちいた発現系を構築した。これらの発現系を用いて、HZSの大量発現条件の検討をまず進める。また、HZSの3つのサブユニットを単独のオペロンとして発現させる系も新たに構築し、大量発現条件の検討を進める。昨年度までに、膜画分に多く発現することも確認しているので、界面活性剤の種類・濃度や塩濃度など可溶化条件の検討も併せて進める。
大量発現したHZSの精製は、既報の手法（Kartal et al., Nature 2011）に従って進める。アミノ酸配列からHZSは4つのheme cを有すると推定されているので、HZSに含まれるヘムおよび金属を定量する。また、ヒドラジン合成活性を既報の被食法により測定する。これらHZSの性質を確認したうえで、結晶化スクリーニングを進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ヒドラジン合成酵素のクローニングが計画よりも早く完了したため、酵素などの消耗品の支出がわずかながら計画を下回った。
金額はわずかであるが、当初計画を前倒して進めることになる好熱性アナモックス菌由来のヒドラジン合成酵素の大量発現に必要な消耗品に使用する。
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