| 研究課題/領域番号 |
25291018
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
西野 達哉 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助教 (50533155)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 酵素反応 / 生物物理 / 分子認識 / 蛋白質 |
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| 研究概要 |
本年度はCENP-SX複合体とCENP-TW複合体のそれぞれ複合体としての生物物理学的な解析とDNAとの相互作用に関しての解析を行った。まず分析用超遠心によりCENP-SX, CENP-TW, CENP-TWSXを解析したところ、それぞれ４量体、２量体、4量体を形成していた。３つの異なる濃度で測定しても同じ会合状態であることからそれぞれ安定な複合体を形成していることがわかった。続いてBIAcoreとITCを使ってCENP-TWとCENP-SXの相互作用を解析した。その結果、CENP-TWとCENP-SXの解離定数を求めることができた。ITCによる測定では解離定数は約600-900nMの範囲であった。一方、BIAcoreを使って解離定数を測定したところ、解離定数は1.6uMから2uMであった。
続いてCENP-SXとDNAの相互作用をゲルシフト法とゲル濾過法により測定した。その結果、ゲルシフト法ではフリーのDNAがまだ残っている状態で1:1複合体以外にも2:1や3:1複合体がラダー状のバンドとして観測できた。一方、ゲル濾過により相互作用を解析したところ、CENP-SX４量体とDNAが1:1のときにほぼフリーのDNAピークが消失した。ある程度の長さの二重鎖(40bp-60bp)では蛋白質を更に加えると次のピークが存在することからゲルシフト法で観測できる2:1複合体も観察できた。
更にこのような解析結果を利用してCENP-SX-DNA複合体の結晶化を行った。その結果、CENP-SXと49bp二重鎖DNAの結晶を得ることに成功した。分解のはまだ６オングストローム程度のため現在結晶化やクライオ凍結条件を改善中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度はCENP-SXとCENP-TWの生物物理学的解析を行うことができ、それぞれの相互作用を定量することができた。またCENP-SXやCENP-TWとDNAの相互作用についても解析することができた。更にCENP-SXとDNAの複合体結晶を得ることに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はこれまでに作成しているCENP-SXとDNAの複合体結晶の高分解能X線結晶回折データを得ること、また本結晶の位相を決定することで構造解析につなげる。そのために結晶化条件の改善やクライオ凍結条件の改善を行うとともにセレノメチオニン置換CENP-SXやヨードラベルした二重鎖DNAを調製し位相決定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の予定では初年度に大規模な蛋白質-DNA複合体調製を行う予定であったが、まずは蛋白質の生物物理学的な性状決定に専念したため、当初の予定と比較して蛋白質複合体調製に関わる費用や結晶化に関わる費用が少なくなった。
次年度は蛋白質複合体調製や結晶化を大規模に行う予定であり、蛋白質精製試薬や精製カラム、結晶化用合成オリゴDNAに利用する予定である。
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