| 研究課題/領域番号 |
25291024
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
澤田 均 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (60158946)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | プロテアソーム / ユビキチン / 受精 / ホヤ / 精子 / プロテアーゼ / ユビキチン化酵素 |
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| 研究概要 |
（１）精子細胞外ユビキチン化酵素の研究：当初、HrVC70をユビキチン化する酵素複合体をマボヤ精子から精製することを計画していた。しかし、HrVC70ユビキチン化活性の再現性がとれず、測定方法が確立されなかった。そこで方針を変更し、精子で発現されるユビキチン化酵素の遺伝子をdatabaseから探索した。従来、ユビキチン活性化酵素E1は細胞に1種類しか存在しないと考えられてきたが、最近精巣特異的に発現する新規酵素E1L2が報告された。そこでこのオルソログの探索を行った。その結果、マボヤではE1に加えてE1L2のオルソログが発見された。カタユウレイボヤにはE1しか存在が確認されなかった。現在この遺伝子のcDNAクローニングを行っており、平成26年度は、この酵素に対する抗体を作製して精子細胞内局在性解析と受精阻害実験等を行う。また、精子細胞膜表面をビオチン標識し、アビジンカラムで精製して、そのタンパク質をLC/MS/MSを用いて解析する。その中に、E1L2が存在するか否かを検討する。さらに、E2やE3の候補分子の探索も行う。それに加えて、E1L2と相互作用するタンパク質を生化学的手法を用いて探索する。
（２）精子プロテアソームの研究：マボヤプロテアソームにおいては、精子特異的にα6サブユニットのC末端がプロセシングされることを見いだしている。そこでプロセシング後に出現するC末端ペプチドに対するペプチド抗体を作製し、透過処理前後で精子の免疫染色を行った。その結果、精子表面にプロテアソームが存在し、それがα6においてプロセシングされているという予備的結果を得た。今後は、このC末端と相互作用する精子膜タンパク質を探索する一方で、精巣特異的に発現するプロテアソームアクティベーターPA200の探索と受精における役割についても解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度は、精子細胞外ユビキチン化酵素の精製のための活性測定方法の確立を目指したが、再現性のある結果が得られなかった。この点では当初の予定より進行が遅れたが、その後、精巣で発現する新規ユビキチン活性化酵素E1L2のオルソログが発見されてからは研究が順調に進んでいる。さらにプロテアソームのα６サブユニットのプロセシングに関しても、細胞外輸送に関わる可能性が示唆されたこと、アクティベーターPA200がマボヤゲノム上で新規に発見されたことなど、当初想定していなかった進展も見られた。今後はこれらの視点から解析を進める。
上記のことを総合的に考え、概ね順調に進展していると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）精子細胞外ユビキチン化酵素の研究：マボヤで新規に発見されたユビキチン活性化酵素E1L2の遺伝子のcDNAクローニングを行う。また、ノーザンブロット解析を行い精巣特異的に発現しているか否かを検討する。この酵素に対する抗体を作製して精子細胞内局在性解析と受精阻害実験等を行う。また、抗体を用いて免疫沈降実験を行い、E1L2と共沈するタンパク質を探索する。一方、精子細胞膜表面をビオチン標識し、アビジンカラムで精製して、そのタンパク質をLC/MS/MSを用いて網羅的に解析する。その中に、E1L2が存在するか否かを検討する。さらに、E2やE3の候補分子の探索も行う。それに加えて、E1L2と相互作用するタンパク質をプルダウン実験等の生化学的手法を用いて探索する。
（２）精子プロテアソームの研究：マボヤ精子表面にプロテアソームが存在し、それがα6においてプロセシングされているという予備的結果を得ているので、平成26年度はその再現性を確かめる。また、このC末端と相互作用する精子膜タンパク質を探索する。さらに、精巣特異的に発現するプロテアソームアクティベーターPA200の探索と受精における役割についても解析する。マボヤゲノム上ではPA200の遺伝子が確認されているので、そのcDNAクローニングとノーザンブロット解析を行う。またPA200に対する特異抗体を作製し、精子局在性解析、受精阻害実験、免疫沈降で共沈するタンパク質の同定などを行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
交付申請時に記載した経費より実支出額が1584円少なかったため、次年度に繰り越すことにした。
試薬購入費に使用する。
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