ゲノムDNAのメチル化模様維持機構に関する研究

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25291025
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 田嶋 正二 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (50132931)
• 研究分担者: 末武 勲 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (80304054)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: DNAメチル化 / DNAメチル化酵素 / DNAメチル化模様維持

研究実績の概要

脊椎動物ゲノムのCpG配列中のシトシン塩基は、しばしばメチル化修飾を受けている。シトシン塩基のメチル化は、遺伝情報発現に抑制的に働く“エピジェネティクス”要因の一つであり、DNAのメチル化による遺伝情報制御は発生・分化に欠くことができない重要な役割を果たしている。メチル化模様は複製の過程で次世代の細胞に正確に伝えられる。この世代を超えたメチル化模様の伝達にはDnmt1と呼ばれるDNAメチル化酵素の一つが責任酵素として働いている。本研究計画ではDnmt1について、へミメチル化（片鎖だけがメチル化された）DNAを認識する機構と、生体内でメチル化模様の維持に必須な因子であるUhrf1（別名Np95）との共役について、構造生物学的、生化学的に明らかにする。本年度はUhrf1とDnmt1が相互作用する責任配列を明らかにした。また、Uhrf1と相互作用するDnmt1のRFTS領域が、ゲノムを複製期以外にメチル化することを防いでいることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Uhrf1の中のヘミメチルDNAに結合するSRA領域とDnmt1の複製フォーク標的化シグナル（RFTS）領域が直接相互作用して、SRAはRFTSを触媒ポケットから追い出すことを明らかにしている。平成26年度は、SRAとRFTSの相互作用がどのアミノ酸配列に依存するのかについて、部位特異的な変異を導入したSRAとRFTS（Dnmt1）を用いて、DNA維持メチル化機構を試験管内で解析することにより明らかにした。以上の成果については投稿準備中である。
RFTS領域が細胞内で維持メチル化にどのように寄与しているのかについて、Dnmt1をN末端側から順次欠失させ、内在的なDnmt1を薬剤で欠失させることができるように細工した胚性幹細胞に発現させ、N末端の領域、特にRFTSの維持メチル化に果たす役割を解析した。その結果、細胞内での維持メチル化はN末端に存在するPCNA結合ドメインは必要ないこと、RFTSが維持メチル化に必要不可欠であることを明らかにした。RFTSは触媒ポケットに嵌まりこむことによって、複製期以外の時期にゲノムをメチル化しないようにしている、安全弁の役割を果たしていることを明らかにした。以上の成果については現在投稿中である。

今後の研究の推進方策

RFTSはDnmt1の触媒領域とは4本の水素結合で係留され、触媒ポケットに嵌まりこんでいる。また、最近RFTS領域が触媒ポケットと接触する、立体構造上特定のスポットに変異が入ると、遅発性の脳神経疾患（ナルコレプシー、運動失調、難聴）が発症する家系が報告された。今年度は、RFTSと触媒領域の相互作用を阻害する部位特異的な変異体と、ヒトで見出された神経疾患に相当する部位特異的な変異が、ES細胞内でのDNA維持メチル化に対する影響と、神経への分化誘導に対する影響について、解析する予定である。

次年度使用額が生じた理由

実験が効率良く進み、経費に無駄が出なかったため。

次年度使用額の使用計画

初年度同様、化学試薬、合成オリゴDNA、培地、RI化合物、制限酵素、修飾酵素などの消耗品の使用が主たる支出である。最終年度である今年度は、以上に加えて、実験の迅速化をはかるために人件費にも充当する。また、成果発表のための旅費を支出する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The epigenetic regulator Uhrf1 facilitates functional expansion of colonic regulatory T cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuuki Obata, Yukihiro Furusawa, Takaho A Endo, Jafar Sharif, Daisuke Takahashi, Koji Atarashi, Manabu Nakayama, Satoshi Onawa, Yumiko Fujimura, Masumi Takahashi, Tomokatsu Ikawa, Takeshi Otsubo, Yuki I Kawamura, Taeko Dohi1, Shoji Tajima, et al.
  • 雑誌名: Nature Immunology 巻: 15 ページ: 571-579
  • DOI: doi: 10.1038/ni.2886
  • 査読あり
• [学会発表] The relative positioning of 5-hydroxymethylcytosine and 5-methylcytosine at promoters correlates with gene expression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Jan Engelhardt, Saori Takahashi, Hironobu Kimura, Tatsuhiro Tomoto, Yuichi Mishima, Masahiro Shirakawa, Takashi Kohda, Norie Tooi, Toru kawakami, Kazuhiro Aiba, Norio Nakatsuji, Peter F. Stadler, Shoji Tajima, and Isao Suetake
  • 学会等名: Keystone Symposium on Epigenomics
  • 発表場所: Keystone Resort, Keystone, Colorado, USA
  • 年月日: 2015-03-29 – 2015-04-03
• [学会発表] Nucleosome compaction allows HP1γ the H3K9 methylation binding (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuichi Mishima, Kai Lu, Junji Otani, Masahiro Shirakawa, Peter Carlton, Shoji Tajima, and Isao Suetake
  • 学会等名: Keystone Symposium on Epigenomics
  • 発表場所: Keystone Resort, Keystone, Colorado, USA
  • 年月日: 2015-03-29 – 2015-04-03
• [学会発表] マウスES細胞での5hmC化を介した脱メチル化後のDnmt1の役割 (2014)
  • 著者名/発表者名: 首浦武作志、岡野正樹、木村博信、田嶋正二、多田政子
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] 組換えDNMT1を用いたヒドロキシメチルシトシンの一塩基解像度の検出方法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高橋沙央里、末武勲、Jan Engelhardt、幸田尚、田嶋正二
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] HP1γによるヌクレオソーム構造依存的なヒストンH3K9me3の認識機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 三島優一、川上徹、大谷淳二、木村博信、白川昌宏、田嶋正二、末武勲
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] Dnmt1（RFTS）とUhrf1（SRA）の相互作用によりDNAは触媒中心に近づけるようになる (2014)
  • 著者名/発表者名: アーメット・キャン・ベルキュレック、末武 勲、有田 恭平、竹下 浩平、中川 敦史、白川 昌宏、田嶋 正二
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] 遺伝性知覚神経疾患の原因となるDnmt1のRFTS内の変異がDNA維持メチルに及ぼす影響 (2014)
  • 著者名/発表者名: ロナルド・G・ガルビレス、木村 博信、アーメット・キャン・ベルキュレック、末武 勲、田嶋 正二
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] 組換えDNMT1を利用したヒドロキシメチル化シトシンの1塩基レベルの新規解析方法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 末武勲、白川昌宏、田嶋正二
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] プロモーター領域でのヒドロキシメチルシトシンのメチルシトシンに対する相対位置は遺伝子発現と相関する (2014)
  • 著者名/発表者名: 木村博信、末武 勲、遠井 紀江、川上 徹、饗庭一博、中辻憲夫、田嶋正二
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] マウスES細胞における5mCと5hmCの連続変換によるメチル化制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 首浦武作志、岡野正樹、木村博信、田嶋正二、多田政子
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] Effect of DNMT1 mutation in neuronal differentiation of neural stem cell (2014)
  • 著者名/発表者名: Chiara Soldati, Ronald G. Garvilles, Shoji Tajima and Kinichi Nakashima
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究第８回年会
  • 発表場所: 東京大学伊藤国際会館
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24